應(yīng)曼曼，張曉楠，劉然，寧宏

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院眼科，沈陽 110001）

脈絡(luò)膜黑色素瘤是成人最常見的原發(fā)性眼內(nèi)惡性腫瘤，病因尚不明確，常發(fā)生于50～60歲，易通過血液循環(huán)轉(zhuǎn)移［1-3］。許多患者在出現(xiàn)臨床或影像學(xué)轉(zhuǎn)移之前，通常已經(jīng)有多年的肝轉(zhuǎn)移［4］。早期發(fā)現(xiàn)和治療有助于提高患者的生存率和改善預(yù)后，因此，深入研究脈絡(luò)膜黑色素瘤的發(fā)生和調(diào)控機制將有助于發(fā)現(xiàn)腫瘤發(fā)生相關(guān)的關(guān)鍵靶分子，為脈絡(luò)膜黑色素瘤的治療提供新的靶點。

非編碼RNA （non-coding RNAs，ncRNAs） 包括微小RNA （microRNAs，miRNAs）、長鏈非編碼RNAs（long ncRNAs，lncRNAs） 和環(huán)狀非編碼RNAs（circular RNAs，circRNAs）。研究表明，miRNAs在腫瘤中發(fā)揮負調(diào)控作用。miR-9-5p能調(diào)控甲狀腺癌［5］、胰腺癌［6］等的發(fā)生發(fā)展，但關(guān)于它在脈絡(luò)膜黑色素瘤細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲中的調(diào)控作用尚未見報道。本研究通過轉(zhuǎn)染miR-9-5p 至人脈絡(luò)膜黑色素瘤細胞，觀察細胞的增殖、凋亡、遷移及侵襲的變化情況，并分析miR-9-5p作用的靶基因，旨在探討其在脈絡(luò)膜黑色素瘤中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

取凍存的人眼侵襲性脈絡(luò)膜黑色素瘤細胞系MUM-2B和MUM-2C （上海拜力生物技術(shù)有限公司），在溫水中快速搖晃溶解。用含10%胎牛血清 （美國Gibco公司） 的MEM培養(yǎng)基 （美國HyClone公司），于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞。陰性對照（negative control，NC）為隨機序列RNA Oligo，miR-9-5p mimics序 列 為5’-UCUUUGGUUAUCUAGCUGUAUGA-3’，miRNA由蘇州吉瑪基因公司合成，用Lipofectamine 3000 （美國Life Technologies Corporation公司） 進行瞬時轉(zhuǎn)染。

1.2 RTCA實時增殖實驗

取對數(shù)生長期細胞轉(zhuǎn)染24 h后，消化并離心，去上清。加入有血清培養(yǎng)基重懸細胞，將細胞懸液與臺盼藍混勻，細胞計數(shù)儀讀取細胞數(shù)。根據(jù)細胞密度，將每個細胞樣品配置成固定濃度的細胞懸液。在E-plate板 （美國愛森生物有限公司） 中加入有血清培養(yǎng)基50 μL測基線后，加入配置好的細胞懸液（100 μL/孔），利用RTCA軟件啟動細胞實時增殖分析，連續(xù)測定72 h，得出細胞增殖曲線。

1.3 EDU細胞增殖實驗

miR-9-5p mimics轉(zhuǎn)染細胞48 h，換液后以EDU（上海碧云天生物技術(shù)有限公司） 孵育4 h，消化并離心，以4%多聚甲醛固定15 min，用0.5%TrionX-100通透細胞15 min，用Asize488反應(yīng)液避光孵育細胞30 min后，以流式細胞儀 （美國BD公司） 檢測細胞的增殖變化。

1.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡

轉(zhuǎn)染處于對數(shù)生長期的細胞48 h，消化并離心。將細胞凋亡試劑盒 （美國BD公司） 的Binding Buffer（10×） 用預(yù)冷PBS稀釋成1× Binding Buffer。將各細胞樣品以200 μL的1×Binding Buffer重懸。各樣品中加入3 μL FITC后，繼續(xù)加入3 μL PI，分別室溫避光孵育10 min，繼續(xù)加入300 μL 1×Binding Buffer并充分混勻。以流式細胞儀收集并檢測10 000個細胞，分析細胞凋亡情況。

1.5 Transwell遷移侵襲實驗

將細胞常規(guī)轉(zhuǎn)染24 h后消化離心，去上清后加入適量有血清培養(yǎng)基重懸細胞，將細胞懸液與臺盼藍混勻，以細胞計數(shù)儀檢測細胞密度，每個樣品配置成固定濃度的細胞懸液。不做任何處理的小室直接用于遷移實驗，加基質(zhì)膠的小室用于侵襲實驗。24孔板中每孔加入600 μL有血清培養(yǎng)基，將配置好的細胞懸液200 μL加入到每個小室并置于24孔板中，孵箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，棄小室內(nèi)的無血清培養(yǎng)基，將小室底部置于結(jié)晶紫中染色15 min，吸干擦凈小室，顯微鏡下拍照。

1.6 生物信息學(xué)軟件分析預(yù)測miR-9-5p的靶基因

利用miRNAs靶基因預(yù)測的生物信息學(xué)網(wǎng)站TargetscanHuman7.2 （http://www.targetscan.org/vert_72/） 分析找出miR-9-5p的所有靶基因。將miR-9-5p的所有靶基因輸入DAVID 6.8 （Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery） 生信分析網(wǎng)站 （https://david.ncifcrf.gov/home.jsp），進行綜合生物學(xué)功能分析，用GO生物學(xué)功能富集分析及KEGG信號通路分析，篩選相關(guān)靶基因。最后將所得2組靶基因輸入Venny2.1在線分析軟件 （http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/），取交集找出與細胞遷移和侵襲功能相關(guān)的關(guān)鍵差異基因。

1.7 Western blotting

以RIPA裂解液 （上海碧云天生物技術(shù)公司） 提取各組細胞總蛋白，用BCA蛋白檢測試劑盒 （上海碧云天生物技術(shù)公司） 檢測蛋白濃度。每孔30 μg蛋白上樣，行10% SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜 （美國BIO-RAD公司）。5%脫脂奶粉封閉2 h，加入CDH1抗體 （（1︰5 000，ab40772，美國Abcam公司） 和GAPDH抗體 （1︰5 000，5174s，美國Cell Signaling Technology公司），4 ℃孵育過夜。TBST清洗3次后，以二抗 （山羊抗兔1︰5 000，ZB-2301，北京中山金橋生物技術(shù)有限公司） 封閉1 h。利用發(fā)光儀MicroChemi4.2 （以色列DNR公司） 檢測條帶熒光亮度，并以ImageJ軟件計算灰度值并分析蛋白表達量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

圖1 miR-9-5p對脈絡(luò)膜黑色素瘤細胞增殖的影響Fig.1 The effect of miR-9-5 on proliferation of choroidal melanoma cells

采用GraphPad Prism7.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析與作圖，實驗數(shù)據(jù)以表示。采用兩樣本t檢驗分析比較2組實驗數(shù)據(jù)，每個實驗均獨立重復(fù)3次，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-9-5p抑制脈絡(luò)膜黑色素瘤細胞的增殖

利用RTCA細胞實時增殖實驗觀察各組細胞的增殖情況，與NC組相比，MUM-2B （t=6.925） 和MUM-2C （t=4.762） 細胞轉(zhuǎn)染miR-9-5p mimics后，細胞增殖能力明顯下降 （P＜ 0.01），見圖1A。用EDU細胞增殖實驗進一步驗證miR-9-5p對細胞增殖的影響，結(jié)果表明，MUM-2B （t=4.779） 和MUM-2C （t=4.514） 細胞轉(zhuǎn)染miR-9-5p mimics后，細胞的增殖能力明顯減弱 （P＜ 0.05），見圖1B、1C。提示miR-9-5p能夠抑制脈絡(luò)膜黑色素瘤細胞的增殖。

2.2 miR-9-5p能夠促進脈絡(luò)膜黑色素瘤細胞的凋亡

采用流式細胞儀檢測各組脈絡(luò)膜黑色素瘤細胞的凋亡變化情況。如圖2所示，與NC組相比，MUM-2B （t=7.385） 和MUM-2C （t=4.893） 細胞轉(zhuǎn)染miR-9-5p mimics后凋亡率明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.001），見圖2A、2B。脈絡(luò)膜黑色素瘤細胞的凋亡水平與miR-9-5p的表達量呈正相關(guān)，表明miR-9-5p能夠促進脈絡(luò)膜黑色素瘤細胞的凋亡。

圖2 流式細胞技術(shù)檢測miR-9-5p對脈絡(luò)膜黑色素瘤細胞凋亡的影響Fig.2 The effect of miR-9-5p on the cell apoptosis of choroidal melanoma cells detected by flow cytometry

2.3 miR-9-5p能夠參與調(diào)控脈絡(luò)膜黑色素瘤細胞的遷移和侵襲

Transwell遷移和侵襲實驗結(jié)果顯示，與NC組相比，MUM-2B （t=7.223） 及MUM-2C （t=11.03） 轉(zhuǎn)染miR-9-5p mimics后，遷移細胞量均顯著減少 （P＜0.05）；與NC組相比，MUM-2B （t=8.271） 及MUM-2C（t=11.42） 轉(zhuǎn)染miR-9-5p mimics后，侵襲細胞量均顯著減少 （P＜ 0.05），見圖3。提示miR-9-5p亦能抑制脈絡(luò)膜黑色素瘤細胞的遷移和侵襲。

2.4 生物信息學(xué)方法篩選miR-9-5p參與細胞增殖轉(zhuǎn)移調(diào)節(jié)的靶基因

為了深入研究miR-9-5p在脈絡(luò)膜黑色素瘤細胞中發(fā)揮作用的分子調(diào)節(jié)機制，采用生物信息學(xué)網(wǎng)站TargetScanHuman7.2 （http://www.targetscan.org/vert_72/）分析預(yù)測miR-9-5p可能作用的靶基因，得到1 388個miR-9-5p的靶基因。將靶基因輸入DAVID6.8在線分析軟件，進一步通過GO生物學(xué)分析，找到參與調(diào)控細胞遷移侵襲的基因78個，通過KEGG信號通路分析，找到參與調(diào)控細胞遷移侵襲的基因51個。經(jīng)過Venny2.1在線分析工具分析，在上述2組與細胞遷移侵襲相關(guān)的基因群中找出3個共同差異表達的基因（CDH1，CTNNA1，ITGA6）。

2.5 驗證CDH1是miR-9-5p的靶基因

為驗證CDH1，CTNNA1，ITGA6是否為miR-9-5p的靶基因，隨機選擇性地對CDH1進行實驗驗證。給予MUM-2B和MUM-2C細胞轉(zhuǎn)染miR-9-5p mimics后，以Western blotting檢測不同分組的CDH1蛋白表達變化情況。如圖4所示，與NC組相比，轉(zhuǎn)染miR-9-5p mimics組MUM-2B和MUM-2C細胞CDH1的表達均下調(diào)。

3 討論

脈絡(luò)膜黑色素瘤作為成人最常見的原發(fā)性眼內(nèi)惡性腫瘤，其表現(xiàn)多種多樣，并發(fā)癥多，惡性程度高，易侵襲轉(zhuǎn)移，預(yù)后極差［7］。脈絡(luò)膜黑色素瘤的發(fā)生機制可能與染色體畸形、基因突變及信號通路有關(guān)［8］，其中信號通路是目前的研究熱點［9］。研究［10-12］發(fā)現(xiàn)，多種miRNAs參與調(diào)控腫瘤細胞的生物學(xué)行為，并已成為腫瘤治療的潛在靶點。miRNAs在脈絡(luò)膜黑色素瘤的增殖、代謝、凋亡及侵襲遷移過程中也發(fā)揮著重要作用［13-15］。miRNAs是一類長度約22 nt的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，通過與mRNA 3 ’UTR靶向結(jié)合調(diào)節(jié)基因的表達，影響信號通路的激活和抑制狀態(tài)，從而調(diào)控腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。文獻［15］報道，miR-155可通過調(diào)節(jié)NDFIP1的表達促進葡萄膜黑色素瘤細胞增殖和侵襲。

圖3 Transwell實驗檢測miR-9-5p對脈絡(luò)膜黑色素瘤細胞遷移和侵襲變化的調(diào)控作用Fig.3 The regulatory effect of miR-9-5p on the migration and invasion of choroidal melanoma cells examined with Transwell assay

圖4 Western blotting檢測CDH1蛋白表達情況Fig.4 The expression level of CDH1 detected by Western blotting

miR-9-5p在多種腫瘤中發(fā)揮著促進因子或抑制因子的作用［16-19］，但它在脈絡(luò)膜黑色素瘤中的作用機制目前尚不明確。因此，本研究通過在脈絡(luò)膜黑色素瘤細胞中過表達miR-9-5p，發(fā)現(xiàn)miR-9-5p表達上調(diào)能夠抑制脈絡(luò)膜黑色素瘤細胞的增殖、遷移和侵襲，并促進脈絡(luò)膜黑色素瘤細胞的凋亡。為了更加深入地研究miR-9-5p在脈絡(luò)膜黑色素瘤細胞中的作用機制及途徑，本研究利用生物信息學(xué)網(wǎng)站TargetscanHuman7.2分析預(yù)測了miR-9-5p的全部可能靶基因。隨后利用GO分類富集分析及KEGG通路分析上述預(yù)測靶基因，篩選得到了3個與細胞遷移和侵襲相關(guān)的基因CDH1，CTNNA1和ITGA6。最后以Western blotting初步驗證了CDH1是miR-9-5p的靶基因之一。CDH1和CTNNA1屬于鈣黏著蛋白家族，介導(dǎo)細胞與細胞間的黏附，與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化引起的侵襲性增加有關(guān)［20-21］。ITGA6能促進腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移［22］。因此，推測miR-9-5p可能通過調(diào)節(jié)上述基因的表達影響脈絡(luò)膜黑色素瘤細胞的發(fā)生與發(fā)展。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)miR-9-5p能夠抑制脈絡(luò)膜黑色素瘤細胞的增殖、遷移和侵襲，促進脈絡(luò)膜黑色素瘤細胞的凋亡，并預(yù)測其機制可能與調(diào)節(jié)CDH1，CTNNA1和ITGA6的表達有關(guān)，為脈絡(luò)膜黑色素瘤的診斷和治療提供了一種新的思路。