陳蕓，孫媛媛，富偉能

（中國醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室，沈陽 110122）

喉癌是發(fā)生在喉部的惡性腫瘤，以鱗狀細(xì)胞癌多見，是耳鼻喉科最常見的惡性腫瘤之一［1］。在我國，喉癌約占全身惡性腫瘤的2.1%，占頭頸部腫瘤的13.9%，且發(fā)病率仍呈上升趨勢(shì)［2-4］。喉癌患者以40～60歲為主，在我國東北和華北地區(qū)發(fā)病率高，且男性發(fā)病率高于女性［2-4］。喉癌的發(fā)病與吸煙、飲酒、性激素水平、人乳頭瘤病毒 （human papilloma virus，HPV） 感染、職業(yè)因素、空氣污染等因素有關(guān)，其中吸煙和飲酒是主要危險(xiǎn)因素［5］。目前，喉癌相關(guān)研究雖有很大進(jìn)展，但其發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制仍不清楚。因此，從分子水平研究喉癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制顯得尤為重要，為喉癌分子診治的深入研究提供線索。

MYCT1是本課題組前期發(fā)現(xiàn)的與喉癌相關(guān)的基因［6］。在喉癌中MYCT1是潛在的抑癌基因，能夠抑制喉癌細(xì)胞增殖和遷移能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［7-8］。PRSS21基因編碼膜蛋白睪丸素，特異性表達(dá)于睪丸［9］。研究［10］發(fā)現(xiàn)，PRSS21在腫瘤中參與多種生物學(xué)功能的調(diào)控。前期本課題組通過iTRAQ技術(shù)在穩(wěn)轉(zhuǎn)MYCT1的喉癌細(xì)胞中檢測(cè)到PRSS21蛋白表達(dá)降低，提示PRSS21與喉癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。本研究擬在喉癌細(xì)胞中初步探討MYCT1對(duì)PRSS21表達(dá)的影響及其通過PRSS21對(duì)喉癌細(xì)胞增殖和遷移能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

人喉癌細(xì)胞系Hep-2細(xì)胞、人口腔角質(zhì)細(xì)胞系HOK細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院；喉癌樣本來自解放軍北部戰(zhàn)區(qū)空軍醫(yī)院耳鼻喉科；MYCT1過表達(dá)載體、空質(zhì)粒載體購自中國基凱公司；si-MYCT1、si-PRSS21和NC購自中國生工公司；胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；RNAiso Plus、Primescript RT reagent Kit購自日本TaKaRa公司；jetPRIME transfection reagent購自法國Polyplus公司；SYBR qPCR Master Mix購自美國Vazyme公司；細(xì)胞膜蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購自中國碧云天公司；BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒購自中國凱基生物公司；anti-MYCT1antibody ab107968購自英國abcam公司；alpha Tubulin Mouse Monoclonal antibody、ATP/A/ Rabbit PolyAb購自美國Proteintech公司；PRSS21antibody購自中國absin公司；Cell Counting Kit-8購自美國bimake公司；1%結(jié)晶紫染色液購自中國Solarbio公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):人喉癌細(xì)胞系Hep-2細(xì)胞接種于含10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640完全培養(yǎng)基中，人口腔角質(zhì)細(xì)胞系HOK細(xì)胞接種于含10%胎牛血清、100 μg/mL青霉 素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基中，兩者均在5%CO2、37 ℃及飽和濕度的條件下常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至對(duì)數(shù)生長期時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染:轉(zhuǎn)染前1 d，將對(duì)數(shù)生長期的Hep-2細(xì)胞以3×105/孔接種于6孔板中，每孔加入2 mL完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到60%～70%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將MYCT1過表達(dá)載體、空質(zhì)粒載體、si-MYCT1、si-PRSS21和NC等分別加入jetPRIME Buffer中，再加入jetPRIME Transfection Reagen配制轉(zhuǎn)染混合液，渦旋10 s室溫孵育10 min。將孵育好的混合液加入6孔板中，混勻，培養(yǎng)6 h后更換RPMI 1640完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后收取細(xì)胞用于實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)，72 h后收取細(xì)胞用于Western blotting檢測(cè)。

過表達(dá)MYCT1實(shí)驗(yàn)分組為空載體對(duì)照組和MYCT1組；干擾MYCT1實(shí)驗(yàn)分組為NC對(duì)照組和si-MYCT1組；細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)分組為NC對(duì)照組、si-PRSS21組、si-MYCT1組和si-MYCT1+si-PRSS21共轉(zhuǎn)染組。

1.2.3 實(shí)時(shí)PCR檢測(cè):取細(xì)胞、喉癌組織和癌旁組織，提取總RNA并檢測(cè)RNA純度和濃度。使用反轉(zhuǎn)試劑盒配置反轉(zhuǎn)體系將RNA反轉(zhuǎn)為cDNA，反應(yīng)條件為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ +∞。以cDNA為模板按照SYBR qPCR Master Mix配置擴(kuò)增體系，進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR，反應(yīng)條件為95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 34 s，共40個(gè)循環(huán)，溶解曲線分析:65～95 ℃。結(jié)果用2-ΔΔCt法計(jì)算并用相對(duì)定量表示。實(shí)時(shí)PCR引物序列見表1，GAPDH為內(nèi)參基因。

表1 實(shí)時(shí)PCR引物序列Tab.1 Sequences of the primers used in this study （real-time PCR）

1.2.4 Western blotting檢測(cè):取細(xì)胞、喉癌組織和癌旁組織，用細(xì)胞膜蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒提取漿蛋白和膜蛋白。測(cè)定蛋白濃度后，在蛋白中加入上樣緩沖液，100 ℃煮10 min使蛋白變性。配制10%分離膠和5%濃縮膠，取20 μg蛋白樣品進(jìn)行SDSPAGE瓊脂糖凝膠電泳。在4 ℃、200 mA恒流條件下轉(zhuǎn)膜1 h。用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h。一抗4 ℃孵育過夜、二抗37 ℃孵育1 h后，用超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒發(fā)光顯影，對(duì)結(jié)果進(jìn)行灰度分析。

1.2.5 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn):細(xì)胞轉(zhuǎn)染6 h后，用胰酶消化細(xì)胞重懸成濃度為5×104/mL的細(xì)胞懸液，將其接種于96孔板中，每孔100 μL，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。常規(guī)培養(yǎng)一定時(shí)間 （24 h、48 h和72 h） 后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)孵育2 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的光密度，并繪制曲線圖。

1.2.6 克隆形成實(shí)驗(yàn):細(xì)胞轉(zhuǎn)染6 h后，用胰酶消化細(xì)胞重懸成細(xì)胞懸液，將其接種于6孔板中，3×103/孔，并添加2 mL完全培養(yǎng)基。將6孔板放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞團(tuán)中細(xì)胞個(gè)數(shù)達(dá)到50時(shí)停止培養(yǎng)，甲醇固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，自來水側(cè)面沖洗干凈，拍照計(jì)數(shù)。

1.2.7 劃痕實(shí)驗(yàn):待轉(zhuǎn)染細(xì)胞長滿后，用200 μL無菌移液槍槍頭在6孔板中畫直線，用磷酸緩沖液洗去劃落的細(xì)胞，并拍照記錄。加入無血清和抗生素的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，再次拍照記錄，計(jì)算細(xì)胞遷移距離。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

圖1 PRSS21在喉癌中的表達(dá)情況Fig.1 Expression of PRSS21 in Laryngeal carcinoma

2 結(jié)果

2.1 PRSS21在喉癌中高表達(dá)

采用實(shí)時(shí)PCR和Western blotting 檢測(cè)44例喉癌樣本和細(xì)胞中PRSS21的表達(dá)情況。實(shí)時(shí)PCR結(jié)果顯示，喉癌組織中PRSS21的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P=0.026 6），見圖1A；喉癌細(xì)胞Hep-2細(xì)胞中PRSS21的表達(dá)水平顯著高于口腔角質(zhì)細(xì)胞HOK細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P=0.008 0），見圖1B。Western blotting結(jié)果顯示，PRSS21在口腔角質(zhì)細(xì)胞HOK細(xì)胞中不表達(dá)，在喉癌細(xì)胞Hep-2細(xì)胞中高表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P=0.037 4），見圖1C。

2.2 MYCT1抑制PRSS21在喉癌細(xì)胞中的表達(dá)

采用實(shí)時(shí)PCR和Western blotting檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中MYCT1和PRSS21表達(dá)水平變化。結(jié)果顯示，與對(duì)照組空載體相比，MYCT1組Hep-2細(xì)胞中MYCT1表達(dá)明顯升高 （P=0.005 4和P=0.010 4），但PRSS21表達(dá)降低 （P=0.031 5和P=0.046 8），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖2A、B。與對(duì)照組NC相比，si-MYCT1組Hep-2細(xì)胞中MYCT1表達(dá)明顯降低 （P=0.034 7和P=0.037 5），但PRSS21表達(dá)升高 （P=0.044 9和P=0.024 2），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖2C、D。

2.3 MYCT1通過PRSS21抑制喉癌細(xì)胞的增殖能力

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組NC比，si-MYCT1組Hep-2細(xì)胞在培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后增殖能力顯著增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P=0.046 2，P=0.027 4和P=0.019 6）；si-PRSS21組Hep-2細(xì)胞在培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后增殖能力顯著減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.034 2，P=0.021 9和P=0.036 2），見圖3A。si-PRSS21+si-MYCT1組回復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PRSS21逆轉(zhuǎn)了MYCT1對(duì)喉癌細(xì)胞增殖能力的影響，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P=0.035 2，P=0.048 6和P=0.020 5），見圖3A。

克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組NC比，si-MYCT1組Hep-2細(xì)胞克隆形成數(shù)目顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P=0.025 1）；si-PRSS21組Hep-2細(xì)胞克隆形成數(shù)目顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P=0.038 6），見圖3B。si-PRSS21+si-MYCT1組回復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PRSS21逆轉(zhuǎn)了MYCT1對(duì)喉癌細(xì)胞克隆形成的影響，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P=0.018 5），見圖3B。上述結(jié)果表明，MYCT1可通過PRSS21顯著抑制喉癌細(xì)胞的增殖能力。

圖2 MYCT1對(duì)Hep-2細(xì)胞中PRSS21表達(dá)的影響Fig.2 Effect of the modulation of MYCT1 on the expression of PRSS21 in Hep-2 cells

圖3 MYCT1通過PRSS21對(duì)Hep-2細(xì)胞增殖和克隆形成能力的影響Fig.3 Effect of MYCT1on the PRSS21-mediated proliferation and colony formation of laryngeal cancer cells

2.4 MYCT1通過PRSS21抑制喉癌細(xì)胞的遷移能力

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組NC比，si-MYCT1組Hep-2細(xì)胞在培養(yǎng)24 h后遷移能力顯著增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P=0.014 2）；si-PRSS21組Hep-2細(xì)胞在培養(yǎng)24 h后遷移能力顯著減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P=0.042 7），見圖4。si-PRSS21+si-MYCT1組回復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PRSS21逆轉(zhuǎn)了MYCT1對(duì)喉癌細(xì)胞遷移能力的影響，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P=0.027 7），見圖4。上述結(jié)果表明，MYCT1可通過PRSS21顯著抑制喉癌細(xì)胞遷移能力。

3 討論

近年來，我國喉癌的發(fā)病率不斷上升［2-4］。喉癌是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一，研究影響喉癌生物學(xué)功能的基因?qū)戆┑脑\斷和治療具有重要意義。

圖4 MYCT1通過PRSS21對(duì)Hep-2細(xì)胞遷移能力的影響Fig.4 Effect of MYCT1 on the PRSS21-mediated migration of laryngeal cancer cells

研究［9］表明，PRSS21具有組織特異性，發(fā)揮促進(jìn)或抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用。PRSS21正常表達(dá)于減數(shù)分裂前睪丸生殖細(xì)胞，在睪丸生殖細(xì)胞腫瘤中不表達(dá)，PRSS21是睪丸腫瘤發(fā)生的抑制因子［11-12］。PRSS21在其他正常組織中表達(dá)水平很低或不表達(dá)，在卵巢癌、宮頸癌、胃癌等多種不同來源的腫瘤中高表達(dá)，發(fā)揮促癌作用［9，13-16］。TANG 等［10］證明PRSS21促進(jìn)上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)變，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長，誘導(dǎo)體內(nèi)腫瘤形成。DRIESBAUGH等［16］發(fā)現(xiàn)，PRSS21激活蛋白酶激活受體PAR-2，影響下游信號(hào)通路，抑制卵巢腫瘤細(xì)胞的凋亡。YEOM等［15］首次證明，在宮頸癌中PRSS21阻斷maspin介導(dǎo)的細(xì)胞死亡途徑，增加細(xì)胞的侵襲和遷移，從而促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生。然而PRSS21與喉癌的關(guān)系尚未見報(bào)道。

本研究利用實(shí)時(shí)PCR和Western blotting檢測(cè)PRSS21在正常和喉癌細(xì)胞及組織中的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PRSS21在正常細(xì)胞或組織中不表達(dá)或低表達(dá)，在喉癌細(xì)胞或組織中顯著高表達(dá)。隨后利用CCK-8、克隆形成和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PRSS21對(duì)喉癌細(xì)胞生物功能的影響，結(jié)果顯示，PRSS21能顯著促進(jìn)喉癌細(xì)胞的增殖和遷移。由此推測(cè)PRSS21在喉癌中發(fā)揮促癌作用。研究［8-9］發(fā)現(xiàn)，MYCT1在喉癌中發(fā)揮抑癌作用。進(jìn)一步結(jié)果表明，MYCT1抑制喉癌細(xì)胞中PRSS21的表達(dá)，繼而抑制喉癌細(xì)胞的增殖和遷移能力。

在正常細(xì)胞中，啟動(dòng)子甲基化是調(diào)控基因表達(dá)的重要機(jī)制。而在腫瘤細(xì)胞中，異常啟動(dòng)子甲基化或去甲基化可導(dǎo)致基因異常表達(dá)。PRSS21基因啟動(dòng)子區(qū)包含5個(gè)CpG島和5個(gè)CpG富集區(qū)域，容易被甲基化［9］。KAWANO 等［11］首次證實(shí)在睪丸生殖細(xì)胞腫瘤中PRSS21因啟動(dòng)子高甲基化表達(dá)沉默。隨后KEMPKENSTEFFEN 等［12］發(fā)現(xiàn)了PRSS21基因沉默涉及的異常甲基化CpG位點(diǎn)。本課題組通過iTRAQ技術(shù)在穩(wěn)轉(zhuǎn)MYCT1的喉癌細(xì)胞中檢測(cè)到METTL7A蛋白表達(dá)增加和MBD4蛋白質(zhì)表達(dá)減少 （數(shù)據(jù)未出示）。METTL7A是一種甲基轉(zhuǎn)移酶，促進(jìn)基因啟動(dòng)子甲基化；MBD4是與甲基-CpG結(jié)合域 （MBD） 有關(guān)的核蛋白家族的成員，能夠特異性結(jié)合甲基化DNA，抑制基因啟動(dòng)子甲基化。由此推測(cè)MYCT1可能通過促進(jìn)PRSS21啟動(dòng)子甲基化從而抑制其表達(dá)，進(jìn)而影響喉癌細(xì)胞生物學(xué)功能，但有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，本研究首次證明了MYCT1通過抑制PRSS21的表達(dá)抑制喉癌細(xì)胞的增殖和遷移能力。該研究結(jié)果有助于為MYCY1通過PRSS21參與喉癌發(fā)生發(fā)展分子機(jī)制的深入研究奠定理論基礎(chǔ)。