王麗納，王紅蘭，莊永燦，王凱波，陳文標

（1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院皮膚科，福建 泉州 362000；2.沈陽市第七人民醫(yī)院皮膚科，沈陽 110003；3.泉州醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校病原微生物與免疫學(xué)教研室，福建 泉州 362000）

黑色素瘤起源于黑色素細胞，多發(fā)生于皮膚，易侵襲、轉(zhuǎn)移，并且難以治愈，是皮膚癌中最具侵襲性的腫瘤。雖然黑色素瘤僅占皮膚癌的4%，但死亡人數(shù)約占所有皮膚癌死亡人數(shù)的75%［1-2］。微小RNA（microRNA，miRNA）是細胞內(nèi)的一類小分子RNA，核苷酸片段長度17～25，主要功能是調(diào)控多種基因轉(zhuǎn)錄，通過抑制蛋白的表達繼而調(diào)控細胞的增殖、凋亡等生命活動［3-4］。越來越多的研究［5-6］發(fā)現(xiàn)，黑色素瘤中存在著多種miRNA表達異常，miRNA可能在黑色素瘤進展過程中發(fā)揮著重要的作用。miRNA-146a （miR-146a）作為miR-146家族中的一員，已被證實是很強的促凋亡因子，參與了多種腫瘤增殖、遷移和侵襲的生物學(xué)過程［7-8］。研究［9］發(fā)現(xiàn)，miR-146a通過下調(diào)NUMB蛋白，激活Notch信號參與黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展。本研究通過將miR-146a 模擬物或抑制劑轉(zhuǎn)染入黑色素瘤A375細胞，使 miR-146a過表達或低表達，檢測miR-146a對黑色素瘤細胞A375增殖侵襲能力及對FBXL10蛋白表達的影響，旨在闡明miR-146a在黑色素瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

皮膚黑色素瘤細胞系A(chǔ)375購于中國科學(xué)院上海細胞庫；FBXL10抗體購自美國Cell signalling公司；FBXL10mRNA由大連寶生物有限公司設(shè)計并合成；miR-146a 模擬物、抑制劑及陰性對照均由上海吉瑪公司設(shè)計合成；DMEM培養(yǎng)基、PRMI 1640培養(yǎng)基與胎牛血清購于美國Gibco公司；轉(zhuǎn)染試劑與TRIzol購自美國Invitrogen 公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞轉(zhuǎn)染及分組:收集A375細胞，胰酶消化，重懸制備成細胞懸液并計數(shù)，以3.0×105/孔接種于6孔板，細胞生長達到70%～80%時開始轉(zhuǎn)染，步驟按照說明書進行操作。按照轉(zhuǎn)染物將細胞分為miR-146a模擬物組、miR-146a 抑制劑組及陰性對照組，轉(zhuǎn)染48 h后進行轉(zhuǎn)染效率檢測。

1.2.2 MTT實驗:收集轉(zhuǎn)染后的各組細胞接種于96孔板，密度為1×104/孔，利用MTT檢測試劑盒檢測細胞增殖情況，操作按說明書進行，吸光度值利用酶標儀檢測，波長490 nm，單純加DMSO試劑的孔作為內(nèi)參對照。

1.2.3 Transwell侵襲實驗:將轉(zhuǎn)染后的各組細胞重懸，并將濃度調(diào)整為2×105/mL，小室中聚碳酸酯膜的孔徑為8 μm，在上室內(nèi)加入100 μL細胞懸液，下室內(nèi)加入600 μL完全培養(yǎng)基，孵育24 h，然后以無水甲醇固定，再用棉簽擦去上室內(nèi)的膠與細胞后，結(jié)晶紫染色，鏡下拍照計數(shù)，計算穿膜細胞平均值。

1.2.4 生物信息學(xué)預(yù)測與熒光素酶報告分析:根據(jù)TargetScan （http://www.targetscan.org）、MiRDB（http://mirdb.org/miRDB/）、PITA （http://genie.weizmann.ac.il/pubs/mir07/mir07_data.html） 對miR-146a潛在的靶點進行預(yù)測，選擇FBXL10為其下游靶基因。根據(jù)FBXL10的3’UTR序列設(shè)計引物，擴增后將其克隆到雙熒光素酶報告載體中，轉(zhuǎn)染293T細胞，通過熒光素酶活性變化觀察miR-146a對FBXL10表達的影響。

1.2.5 實時qPCR實驗:收集各組細胞，提取各組細胞的總RNA，測定純度及濃度后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以其為模板進行PCR擴增，反應(yīng)條件為95 ℃，3 min；95 ℃，30s，62 ℃，40s，40個循環(huán)。以U6作為內(nèi)參照，用2-ΔΔCt法來計算結(jié)果。

1.2.6 Western blotting檢測:在轉(zhuǎn)染48 h后，收集A375細胞，超聲波破碎，離心后收集上清，以BCA試劑盒進行蛋白定量，每孔的蛋白上樣量30 μg，SDS電泳，轉(zhuǎn)印，BSA封閉過夜，次日取出后TTBS漂洗，一抗、二抗均于搖床上室溫孵育2 h，TTBS漂洗，ECL發(fā)光，掃描電泳條帶進行光密度值分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染效率檢測結(jié)果

結(jié)果顯示，miR-146a 模擬物組、miR-146a抑制劑組、陰性對照組、未處理組miR-146a表達分別為2.26±0.31，0.51±0.06，1.02±0.06，1.00±0.05。miR-146a 模擬物組miR-146a表達顯著高于陰性對照組 （P＜ 0.01）；miR-146a抑制劑組miR-146a表達顯著低于陰性對照組 （P＜ 0.01），提示miR-146a 模擬物與miR-146a抑制劑轉(zhuǎn)染成功。

2.2 MTT檢測結(jié)果

結(jié)果顯示，miR-146a 模擬物組、miR-146a抑制劑組、陰性對照組、未處理組490 nm的光密度（optied density，OD）值分別為0.65±0.07，1.58±0.16，1.12±0.13，1.06±0.11。與陰性對照組比較，miR-146a模擬物組490 nm的OD值顯著降低 （P＜ 0.01）；miR-146a抑制劑組490 nm的OD值顯著升高 （P＜ 0.01）。而未處理組與陰性對照組比較無統(tǒng)計學(xué)差異 （P＞0.05）。提示miR-146a 模擬物能夠降低A375細胞的增殖能力，miR-146a抑制劑能夠增強A375細胞的增殖能力。

2.3 Transwell侵襲實驗結(jié)果

結(jié)果顯示，與陰性對照組穿膜細胞數(shù) （65.8土6.9） 比較，miR-146a 模擬物組A375細胞的穿膜數(shù)（46.2土5.1） 顯著降低 （P＜ 0.01）；miR-146a 抑制劑組A375細胞的穿膜數(shù) （89.7土8.5） 顯著升高 （P＜0.01）。提示miR-146a 模擬物能夠降低A375細胞的侵襲能力，miR-146a 抑制劑能夠增強A375細胞的侵襲能力，見圖1。

2.4 熒光素酶報告分析結(jié)果

圖1 miR-146a 模擬物和miR-146a 抑制劑對A375細胞侵襲能力的影響×200Fig.1 Effects of miR-146a mimics or inhibitors on the invasive ability of A375 cells ×200

利用熒光素酶報告系統(tǒng)分析miR-146a對FBXL10表達的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，陰性對照組、miR-146a 模擬物+突變組、miR-146a 模擬物+野生型組、miR-146a 陰性對照+突變組、miR-146a 陰性對照+野生型組的相對光素酶活性值分別為1.00±0.00，0.96±0.11，0.48±0.06，0.99±0.11，1.02±0.12。與陰性對照組比較，miR-146a 模擬物+突變組熒光素酶活性無統(tǒng)計學(xué)差異 （P＞ 0.05），而miR-146a 模擬物+野生型組熒光素酶活性顯著降低 （P＜ 0.01），提示FBXL10為miR-146a的下游靶點。

2.5 實時qPCR檢測結(jié)果

結(jié)果顯示，與陰性對照組 （7.22土0.75） 比較，miR-146a 模擬物組（4.85±0.52） A375細胞FBXL10mRNA表達顯著降低 （P＜ 0.01）；miR-146a 抑制劑組（11.29±1.26） A375細胞FBXL10mRNA表達顯著升高 （P＜ 0.01）。

2.6 Western blotting檢測結(jié)果

與陰性對照組 （0.42土0.05） 比較，miR-146a 模擬物組 （0.21±0.02） A375細胞FBXL10蛋白表達顯著降低 （P＜ 0.01）；miR-146a 抑制劑組 （0.69±0.07）A375細胞FBXL10蛋白表達顯著升高 （P＜ 0.01），見圖2。

3 討論

皮膚黑色素瘤是惡性黑色素細胞在皮膚上形成的異質(zhì)性腫瘤，發(fā)病率在西方國家呈現(xiàn)遞增趨勢，患病率每年以3%～8%的速度遞增，手術(shù)切除、化療、免疫治療、放射治療等是目前臨床上常見的治療手段，但治療效果均不理想［10］。因此，闡明皮膚黑色素瘤的發(fā)病機制具有重要意義。

圖2 Western blotting檢測FBXL10的表達結(jié)果Fig.2 FBXL10 expression by Western blotting

miRNA是一種內(nèi)源性非編碼的單鏈RNA，具有序列特異性，能夠調(diào)控腫瘤細胞的增殖、分化、轉(zhuǎn)移和凋亡等生命過程［11］。研究［12-14］發(fā)現(xiàn)，甲狀腺癌和前列腺癌組織中miR-146a表達水平顯著降低。miR-146a具有抑制腫瘤細胞增殖、分化、侵襲等功能，可能扮演抑癌基因的作用，但是miR-146a對黑色素瘤細胞A375 增殖能力的影響尚未見研究報道。

為了闡明miR-146a對黑色素瘤細胞A375 增殖能力的影響，本研究分別用miR-146a 模擬物過表達或抑制劑抑制黑色素瘤A375細胞中miR-146a的表達，然后利用MTT方法檢測黑色素瘤細胞A375 增殖能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)下調(diào)miR-146a的表達能夠顯著增強黑色素瘤A375細胞的增殖能力，而過表達miR-146a則得到相反結(jié)果。隨后又通過Transwell侵襲實驗驗證miR-146a對黑色素瘤A375細胞侵襲能力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)下調(diào)miR-146a的表達能夠顯著增強A375細胞的侵襲能力，過表達miR-146a則得到相反的結(jié)果。但是，miR-146a沉默能夠顯著增強A375細胞增殖和侵襲能力的機制仍需進一步研究。

FBXL10是組蛋白賴氨酸去甲基化酶亞家族JmjC蛋白家族的成員之一，是組蛋白H3賴氨酸36（H3K36） 去甲基化酶，是重要的細胞周期調(diào)控因子，是正常細胞生長發(fā)育的關(guān)鍵因素，對細胞增殖、衰老、腫瘤發(fā)生、細胞死亡發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用［15-17］。在黑色素瘤中，miR-146a是否能夠調(diào)節(jié)FBXL10的表達尚未見研究報道。為了明確FBXL10是否為miR-146a調(diào)控A375細胞增殖和侵襲信號通路的下游靶基因，在下調(diào)miR-146a表達或過表達miR-146a后，本研究采用實時qPCR與Western blotting檢測黑色素瘤A375細胞FBXL10mRNA與蛋白的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達miR-146a后，黑色素瘤A375細胞中FBXL10mRNA與蛋白表達均顯著降低，而在抑制miR-146a 表達后，黑色素瘤A375細胞FBXL10mRNA與蛋白表達均顯著升高。因此認為調(diào)節(jié)FBXL10表達可能是miR-146a調(diào)控A375細胞增殖侵襲能力的作用機制之一。

綜上所述，miR-146a過表達能夠明顯抑制A375細胞的增殖，同時抑制其侵襲能力，其作用機制可能與FBXL10活性被抑制有關(guān)，進而調(diào)節(jié)下游靶蛋白表達，發(fā)揮抗腫瘤作用。本研究為黑色素瘤的臨床治療提供了一定的理論依據(jù)。