吳雪艷，趙依納，王小杰，李美川，李欣

（1.承德醫(yī)學院人體解剖學教研室，河北 承德 067000；2.河北生殖婦產(chǎn)醫(yī)院生殖醫(yī)學科，石家莊 050000；3.承德醫(yī)學院組織與胚胎學教研室，河北 承德 067000；4.承德醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所，河北 承德 067000）

肝癌是常見的惡性腫瘤，具有惡性程度高、進展快、術(shù)后生存期短、易復發(fā)和轉(zhuǎn)移、預后差等特征。探索肝癌的發(fā)病機制，尋求有效的分子治療靶點已成為近年來的研究熱點。半乳糖凝集素3（galectin 3，Gal-3） 是半乳糖凝集素家族成員之一，廣泛表達于正常細胞和腫瘤細胞，已有研究［1-2］證實，Gal-3在肝癌中表達上調(diào)，參與肝癌的發(fā)生發(fā)展，與預后密切相關(guān)。Gal-3是一種新的腫瘤標志物和治療靶點，具體作用機制尚不明確。本研究通過抑制Gal-3在肝癌HepG2細胞中表達，探討Gal-3低表達對肝癌HepG2細胞增殖的影響及作用機制，為肝癌發(fā)生機制的研究及臨床靶向治療提供一定的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑與儀器

人肝癌細胞系HepG2 （上海中科院細胞庫），細胞培養(yǎng)基DMEM （美國Gibco公司），脂質(zhì)體Lipofectamine2000 （Lipo2000）、Trizol試劑和靶向Gal-3 siRNA （美國Invitrogen公司），胎牛血清 （FBS） （杭州四季青公司），RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒和5×蛋白上樣緩沖液 （北京索萊寶生物有限公司），Gal-3、磷脂酰肌醇-3激酶 （phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）、蛋白激酶 （protein kinase B，PKB，AKT）、磷酸化蛋白激酶 （phosphorylated protein kinase B，p-AKT） 和磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白 （phosphorylated mammalian target of rapamycin，p-mTOR） 兔抗人單克隆抗體 （美國Epitomics公司），β-actin兔抗人單克隆抗體 （ABclonal公司），增殖細胞核抗原 （proliferating cell nuclear antigen，PCNA） 小鼠抗人單克隆抗體 （武漢三鷹生物技術(shù)有限公司），山羊抗兔二抗、山羊抗小鼠二抗 （美國KPL公司），Gal-3和β-actin引物（上海生工有限公司設(shè)計并合成），TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒 （大連寶生物工程有限公司），MTT增殖試劑盒 （上海碧云天公司）。主要儀器包括PCR儀 （美國MJ公司）、HER Aceu150型CO2培養(yǎng)箱（德國賀利公司）、MK3酶標儀 （美國Thermo公司）、Tanon 6100化學發(fā)光儀 （上海天能公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞分組及轉(zhuǎn)染:將HepG2細胞分為siRNA干擾組 （轉(zhuǎn)染Gal-3siRNA）、陰性對照組 （轉(zhuǎn)染陰性siRNA） 及空白對照組 （僅加轉(zhuǎn)染試劑）。按5×104/孔在轉(zhuǎn)染前1 d將HepG2種植于6孔板中，使細胞密度24 h內(nèi)達到60%～70%；將siRNA寡核苷酸（20 pmol/L）與無血清DMEM混合成混懸液（終體積250 μL），將Lipo2000與無血清混合成混懸液（終體積250 μL），將2種混懸液在室溫下靜置5 min后輕柔混勻，室溫下靜置20 min。然后將混合物均勻加入培養(yǎng)孔，混勻后在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育；轉(zhuǎn)染后6 h換成含血清培養(yǎng)基。

1.2.2 Western blotting檢測轉(zhuǎn)染后各組細胞Gal-3、PCNA、AKT、p-AKT、p-mTOR蛋白的表達:轉(zhuǎn)染48 h后收集各組細胞，PBS洗滌2次，將150 μL RIPA細胞裂解液加至各孔中，凍融裂解，提取總蛋白，用BCA法檢測蛋白濃度。將5×上樣緩沖液與蛋白混合，煮沸10 min，每孔30 μg，加樣，12%SDS-PAGE凝膠電泳80～120 V，2 h；80 V穩(wěn)壓濕轉(zhuǎn)1.5 h；5%脫脂奶粉封閉2 h；Gal-3兔抗人單克隆一抗、PCNA鼠抗人單克隆一抗 （1 ∶5 000）、AKT、p-AKT、p-mTOR兔抗人單克隆一抗 （1 ∶1 000） 4 ℃孵育過夜；TBST洗膜 （15 min、10 min、5 min）；羊抗兔、羊抗鼠二抗 （1 ∶5 000） 室溫孵育1.5 h；TBST洗膜 （10 min，3次）；采用ECL發(fā)光法顯影，Quantity One 4.62軟件進行條帶分析。

1.2.3 實時qPCR檢測轉(zhuǎn)染后Gal-3mRNA表達:轉(zhuǎn)染后48 h，將1 mL Trizol加入各孔細胞中，提取細胞總RNA，用紫外分光光度計檢測RNA純度，260 nm/280 nm為1.9～2.1 （純度佳），并取0.2 mL RNA進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。符合實驗要求后以其為模板用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。β-actin作為內(nèi)參，Gal-3引物序列:上游5’-TAACCCACGCTTCAATGAGAACAA-3’，下游5’-ACAAGTGAGCATCATTCACTGCAAC-3’；β-actin引物序列:上游5’-TGGCACCCAGCACAATGAA-3’，下游 5’-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3’。反應(yīng)條件:起始模板變性95 ℃ 30 s，1個循環(huán)。PCR循環(huán)中模板變性95 ℃ 5 s，退火，延伸60 ℃ 20 s，均為40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法分析。

1.2.4 MTT法檢測細胞增殖:每24 h檢測1次，轉(zhuǎn)染后胰酶消化細胞，按5×105/mL細胞密度接種于96孔板，各組加入5 mg/mL MTT溶液（20 μL），在5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱孵育4 h，棄培養(yǎng)液加入150 μL二甲基亞砜。酶聯(lián)免疫檢測儀測波長490 nm處各組細胞吸光度 （absorbance，A） 值。按照A490nm值大小繪制細胞增殖曲線。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 靶向Gal-3 siRNA轉(zhuǎn)染HepG2細胞抑制效率的鑒定

結(jié)果顯示，靶向Gal-3 siRNA轉(zhuǎn)染HepG2細胞抑制效率達70%以上。siRNA干擾組Gal-3蛋白及mRNA表達顯著低于陰性對照組和空白對照組 （P＜ 0.05）；而陰性對照組與空白對照組Gal-3蛋白及mRNA的表達比較無統(tǒng)計學差異 （P＞ 0.05），見圖1、表1。

圖1 Western blotting法檢測各組Gal-3蛋白表達Fig.1 Expression of Gal-3 protein in siRNA，negative control，and blank control groups by Western blotting

表1 各組Gal-3蛋白及mRNA的表達Tab.1 Gal-3 protein and mRNA expression in siRNA，negative control，and blank control groups

2.2 Gal-3低表達對HepG2細胞增殖率的影響

MTT法轉(zhuǎn)染后48 h、72 h檢測結(jié)果顯示，siRNA干擾組細胞增殖速率與陰性對照組和空白對照組比較明顯抑制，差異有統(tǒng)計學意義 （P＜ 0.05）；而陰性對照組與空白對照組增殖情況比較無統(tǒng)計學差異 （P＞ 0.05），見圖2。

2.3 各組細胞PCNA、AKT、p-AKT、mTOR及p-mTOR蛋白的表達

結(jié)果顯示，與陰性對照組和空白對照組比較，siRNA干擾組PCNA、p-AKT、p-mTOR的表達明顯降低 （均P＜ 0.05），而AKT、mTOR表達差異無統(tǒng)計學意義 （P＞ 0.05）。陰性對照組與空白對照組比較各蛋白表達均無統(tǒng)計學差異 （均P＞ 0.05），見圖3、表2。

圖2 Gal-3低表達抑制HepG2細胞增殖Fig.2 Gal-3 low expression inhibited proliferation of HepG2 cells

圖3 各組PCNA、AKT、p-AKT、mTOR和p-mTOR蛋白的表達Fig.3 Expression of PCNA，AKT，p-AKT，mTOR，and p-mTOR protein in each group by Western blotting

3 討論

Gal-3基因位于14q21-22染色體上，是半乳糖凝集素家族中唯一具有嵌合體結(jié)構(gòu)的成員，在正常細胞、腫瘤細胞的細胞質(zhì)和細胞膜中廣泛存在［3-4］，可以與細胞表面分子、細胞外基質(zhì)蛋白等多種配體結(jié)合，影響細胞的黏附、生長和凋亡等生物學過程，調(diào)控侵襲、分化和轉(zhuǎn)移［5-7］。研究［8-11］表明，Gal-3在結(jié)直腸癌、乳腺癌、甲狀腺癌、胃癌等多種腫瘤中顯著高表達。敲低Gal-3在胃癌細胞中的表達可抑制細胞增殖［12］；QIAO等［13］亦發(fā)現(xiàn)抑制食管癌中Gal-3表達后細胞增殖和遷移能力顯著降低。本研究MTT結(jié)果顯示，抑制Gal-3表達后細胞增殖能力明顯下降。PCNA是一種表達于細胞核的DNA聚合酶附屬蛋白，其合成和表達與細胞增殖密切相關(guān)。PCNA是評價細胞增殖狀態(tài)的指標［14］。本研究發(fā)現(xiàn)，siRNA干擾組PCNA表達顯著下調(diào)，說明Gal-3低表達抑制了PCNA的表達，證實了Gal-3在肝癌發(fā)生、發(fā)展過程中具有促進細胞增殖的作用。

表2 各組PCNA、AKT、p-AKT、mTOR及p-mTOR蛋白的表達Tab.2 Expression of PCNA，AKT，p-AKT，mTOR，and p-mTOR proteins in each group

PI3K/AKT/mTOR信號通路是細胞內(nèi)重要信號轉(zhuǎn)導通路之一，在細胞的生長、增殖、分化、自噬及腫瘤血管生成等方面發(fā)揮重要作用［15］。PI3K是一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，被G-蛋白耦聯(lián)受體激活后可使其底物磷酸化，進而活化信號通路［16］。AKT作為PI3K下游的效應(yīng)分子，可通過磷酸化作用促進細胞生長和抑制細胞凋亡。當AKT位點全部磷酸化后AKT激活，活化的AKT發(fā)生轉(zhuǎn)位進入胞質(zhì)或胞核，通過TSC1/2復合物進一步激活其下游分子mTOR，從而介導細胞生長［16-17］。mTOR是PI3K相關(guān)激酶家族中的一員，包括mTORC1和mTORC2兩種蛋白復合物，mTORC1通過p-AKT激活AKT，活化的AKT作用于mTORC1，促進腫瘤細胞增殖，增強腫瘤細胞生存力［18-19］。為進一步探究Gal-3表達抑制后HepG2細胞增殖的可能機制，本研究檢測了PI3K/AKT/mTOR信號通路相關(guān)蛋白酶AKT、p-AKT及mTOR、p-mTOR的表達。結(jié)果顯示，在抑制Gal-3表達后，p-AKT和p-mTOR表達均顯著下調(diào)，而AKT、mTOR表達無明顯變化，說明Gal-3低表達抑制了p-AKT和p-mTOR的表達。由此推測Gal-3低表達抑制HepG2細胞增殖，可能是通過抑制了PI3K/AKT/mTOR信號通路的磷酸化實現(xiàn)的。

綜上所述，肝癌HepG2細胞下調(diào)Gal-3蛋白表達后，細胞生長、增殖速度明顯抑制，同時PCNA、p-AKT和p-mTOR表達均降低。說明Gal-3在肝癌細胞中發(fā)揮著促進細胞增殖作用，細胞增殖作用機制可能與激活PI3K/AKT/mTOR信號通路有關(guān)。本研究為肝癌的臨床分子靶向治療提供了潛在靶點，但腫瘤的調(diào)控過程非常復雜，Gal-3在肝癌中的具體作用機制今后將進一步論證。