尹玉,韓碩,王國鋒,王琦,金元哲
(中國醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院心內(nèi)科,沈陽 110032)
透明質(zhì)酸 (hyaluronic acid,HA) 和硫酸軟骨素(chondroitin sulfate,CS) 是2種不同的氨基聚糖,且已證實均是可靠的細胞移植可降解生物支架材料[1]。巨噬細胞可極化為M1和M2型,研究[2]顯示巨噬細胞對組織的炎癥反應起重要作用。M1型巨噬細胞促進炎癥反應[3-4],M2型巨噬細胞起抗炎作用[5-6]。白細胞介素-1β (interleukin-1β,IL-1β)、腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor,TNF-α) 及誘導性一氧化氮合酶 (inducible nitric oxide synthase,iNOS) 為M1型巨噬細胞特征性細胞因子[3,7-9];而精氨酸酶-1(arginase-1,Arg-1) 是M2型巨噬細胞特征性細胞因子[3,7,9-11]。本研究通過實時qPCR檢測IL-1β、TNF-α、iNOS、Arg-1mRNA表達,分析HA和CS對巨噬細胞極化的影響,旨在選擇更好的支架材料,減少細胞移植的炎癥反應和炎癥損傷。
按照已知方法[1]合成CS-N羥基琥珀酰亞胺 (N hydroxysuccinimide,NHS)及HA-NHS。將HA/CS-NHS加入到磷酸鹽緩沖液 (phosphate buffer saline,PBS) 中制成10%混合液,再將混合液和胎牛血清 (體積比為1 ∶1) 制成HA/CS-血清水凝膠。其中CS-血清水凝膠制成中,先在胎牛血清中加入Bobine血清白蛋白(20 g/dL),然后再與CS混合以促進CS-FBS 水凝膠凝固。
1.2.1 骨髓源性巨噬細胞 (bone marrow derived macrophage,BMDM )提取與分化[12-13]:6~8周齡小鼠分離出股骨和脛骨,用25G針頭和10 mL注射器吸取冷PBS液沖洗骨髓,并用70 μm細胞過濾器除去雜質(zhì) (骨質(zhì)、毛發(fā)和其他細胞組織)。在濾過的溶液中加入1×紅細胞裂解液 (10 mL),在37 ℃水浴中培養(yǎng)5 min除去血紅細胞,然后室溫條件下 500g離心5 min,在離心管底部獲得所需細胞,抽吸出上層清液,用BMDM生長液輕輕溶開離心管底部細胞團,放入37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) (24孔板,2×105/孔),每3 d更換新鮮BMDM生長液[12-13],7 d后獲得BMDM。選用未經(jīng)組織培養(yǎng)處理的細胞培養(yǎng)皿培養(yǎng)BMDM以便于細胞分離和收集。將BMDM培養(yǎng)皿自培養(yǎng)箱中取出,放冰面0.5 h,然后輕輕敲彈皿底使細胞脫離培養(yǎng)皿,用移液管吸出[13]。
1.2.2 BMDM水凝膠植入與培養(yǎng):將BMDM細胞(8 000/μL) 混入胎牛血清中,再與10% CS/HA-NHS的PBS混合液 (體積比 1 ∶1) 混合制成HA/CS-血清水凝膠。在凝膠凝固過程中快速抽取凝膠液放入培養(yǎng)板中,凝膠凝固后 (30~60 s) 將IMDM培養(yǎng)液注入培養(yǎng)板內(nèi) (12孔培養(yǎng)板,細胞2×105/孔,水凝膠50 μL/孔)。HA和CS 2組均25個水凝膠標本。
分別在細胞培養(yǎng)0、4、24、48、72 h各組收取5個標本進行實時qPCR分析 (美國Applied Biosystems QuantStudio公司)。使用高純度RNA提取試劑 (荷蘭Roche公司) 提取mRNA。使用 iScript cDNA合成試劑 (荷蘭Bio-Rad公司) 合成cDNA。將cDNA+引物+sensiMix SYBR Hi-ROX (比利時Bioline公司) 共同加入試管制成20 μL溶液。引物[3,7-11]包括M1極化基因IL-1β、TNF和iNOS和M2極化基因Arg-1,內(nèi)參為GAPDH。引物序列為:IL-1β,F(xiàn),5’-GGCAACCGTACC TGAACCCA-3’;R,5’-CCACGATGACCGACACCAC C-3’。TNF,F(xiàn),5’-CCCTCACACTCAGATCATCTTC T-3’;R,5’-GCTACGACGTGGGCTACAG-3’。iNOS,F(xiàn),5’-CCGAAGCAAACATCACATTCA-3’;R,5’-GGTCTAAAGGCTCCGGGCT-3’。Arg-1,F(xiàn),5’-TGTCCCTAATGACAGCTCCTT-3’;R,5’-GCATCCACCCAAATGACACAT -3’。GAPDH,F(xiàn),5’-ATACGGCTACAGCAACAGGG-3’;R,5’-GCCTCTCTTGCTCAGTGTCC-3’。
結(jié)果顯示,與0 h比較,48 h HA水凝膠巨噬細胞中的TNFmRNA和iNOSmRNA增加 (P< 0.05)。與0 h比較,48 h CS水凝膠巨噬細胞中的Arg-1mRNA增加 (P< 0.05)。見表1、2。
巨噬細胞可分為經(jīng)典激活的M1型和替代激活的M2型,它們對炎癥反應的作用完全不同。M1型巨噬細胞促進炎癥反應,破壞細胞外基質(zhì)[3-4],M2型巨噬細胞起抗炎作用,促進細胞外基質(zhì)重建,促進細胞增殖和血管再生[5-6]。研究已經(jīng)證實M1型巨噬細胞加重器官和機體損傷[3-4],M2型巨噬細胞可以減少損傷[4,14]。
表1 實時qPCR檢測HA水凝膠中細胞培養(yǎng)不同時間IL-1β、TNF、iNOS、Arg-1 mRNA結(jié)果Tab.1 mRNA expression of IL-1β,TNF-α,iNOS,and Arg-1 in the context of an HA-based hydrogel at different time points by RT-qPCR
表2 實時qPCR檢測CS水凝膠中細胞培養(yǎng)不同時間IL-1β、TNF-α、iNOS、Arg-1 mRNA表達結(jié)果Tab.2 mRNA expression of IL-1β,TNF-α,iNOS,and Arg-1 in the context of a CS-based hydrogel at different time points by RT-qPCR
有研究[15-16]發(fā)現(xiàn),M1誘導因子LPS/IFN-γ促進HA與巨噬細胞結(jié)合;而M2誘導因子IL-4促使CS與巨噬細胞表面的CD44受體結(jié)合。因此,HA和CS很可能對巨噬細胞表型的轉(zhuǎn)換起不同的作用,即HA使巨噬細胞極化為具有促炎作用的M1型,而CS使巨噬細胞極化為具有抗炎作用的M2型。本研究結(jié)果顯示,HA水凝膠中培養(yǎng)的巨噬細胞TNF-αmRNA和iNOSmRNA增加,TNF-α為M1型巨噬細胞分泌的特征性細胞因子,iNOS為M1型巨噬細胞的特異基因,因此表明HA培養(yǎng)的巨噬細胞很可能向M1型極化;而CS水凝膠培養(yǎng)的巨噬細胞中Arg-1mRNA增加,Arg-1為M2型巨噬細胞的特異基因,表明CS中培養(yǎng)的巨噬細胞很可能向M2型極化。HA和CS對巨噬細胞極化的不同影響可以解釋目前已經(jīng)存在的一些研究結(jié)果,即HA和 CS 在炎癥反應中有相反的作用。細胞移植過程中,HA被組織中和細胞分泌的蛋白酶水解為低聚糖的過程中產(chǎn)生促炎作用[17-18],而CS則具有抗炎作用[19-20]。本研究中HA和CS對巨噬細胞極化的不同影響證實了它們在細胞移植過程中對組織的不同影響,為臨床醫(yī)生選擇更優(yōu)質(zhì)的細胞移植支架材料提供了參考方案。
本研究HA或CS水凝膠培養(yǎng)48 h的巨噬細胞中均檢測出IL-1βmRNA表達增加,這可能與實驗操作導致細胞損傷,致使其出現(xiàn)炎癥應答,釋放IL-1β有關;此外,水凝膠支架材料的觸碰和擠壓也會使細胞損傷,從而釋放IL-1β。本研究不足之處:(1) 檢測的細胞因子種類較少,對不同表型巨噬細胞其他的特征性細胞因子尚未檢測,并且對氨基聚糖極化巨噬細胞過程中啟動的信號通路缺乏驗證;(2) 樣本較小,結(jié)果仍需擴大樣本量進一步證實。
綜上所述,HA可能使巨噬細胞極化為具有促炎作用的M1型,而CS可能使巨噬細胞極化為具有抗炎作用的M2型。因此,與HA比較,CS可以減少組織細胞炎癥損傷,更適合作為細胞移植的支架材料。