郭麗 楊忠杰 于曉濤 賈陸 金少舉 王瑞

摘 要 目的：建立南、北五味子藥材的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，并進行化學模式識別分析。方法：采用HPLC法，以五味子甲素為參照，繪制南、北五味子各10批樣品（編號分別為N1～ N10、S1～ S10）的HPLC指紋圖譜;采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》進行相似度評價，確定共有峰;采用SPSS 20.0和SIMCA 14.1軟件進行聚類分析（HCA）、無監(jiān)督模式主成分分析（PCA）、有監(jiān)督模式正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）;以變量重要性投影值（VIP）大于1為標準，篩選影響南、北五味子質量的差異標志物。結果：南、北五味子分別指認出32、33個共有峰;10批南五味子和10批北五味子的相似度均大于0.9，南、北五味子的相似度為0.50;南、北五味子共有19個共有特征峰，共指認出其中的5個，即五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素。HCA結果顯示，N1～N10聚為一類，S1～S10聚為一類，其中N1、N3、N8、N9聚為一類，其余聚為一類;S1、S3、S6、S9聚為一類，其余聚為一類。無監(jiān)督模式PCA結果顯示，前2個主成分因子的累積方差貢獻率為87.19%。有監(jiān)督模式OPLS-DA結果顯示，五味子甲素、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子乙素為影響南、北五味子藥材質量的差異標志物（VIP值分別為2.29、2.24、1.73、1.48）。結論：本研究所建立南、北五味子HPLC指紋圖譜準確、科學、簡便易行，結合多元統(tǒng)計分析可用于評價南、北五味子藥材的質量。南、北五味子成分有所不同，五味子甲素等為差異標志物。

關鍵詞 南五味子;北五味子;高效液相色譜法;指紋圖譜;聚類分析;主成分分析;正交偏最小二乘法-判別分析;差異標志物

中圖分類號 R284.1 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2020）18-2224-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.18.09

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish HPLC fingerprint of Schisandra sphenanthera and S. chinensis， and to analyze chemical pattern recognition. METHODS： HPLC method was adopted. Using schizandrin A as reference， HPLC fingerprints of 10 batches of S. sphenanthera and S. chinensis （N1-N10， S1-S10） were drawn. Similarity Evaluation System of TCM Chromatographic Fingerprint （2012 edition） was adopted for similarity evaluation to determine the common peaks. SPSS 20.0 and SIMCA 14.1 software were used for HCA， unsupervised madel of PCA， supervised model of OPLS-DA. Using variable importance projection （VIP） value greater than 1 as the standard， the differential markers that affected the quality of S. sphenanthera and S. chinensis were screened. RESULTS： S. sphenanthera and S. chinensis were identified 32 and 33 common peaks， respectively. The similarity of 10 batches of S. sphenanthera and 10 batches of S. chinensis were all higher than 0.9， and the similarity of S. sphenanthera and S. chinensis was 0.05. A total of 19 characteristics peaks were identified， among which five common peaks were identified as schisandraol A， schisandraol B， schisantherin A， schizandrin A and schisandrin B by reference. HCA results showed that N1-N10 were clustered into one category， and S1-S10 were clustered into one category， of which N1， N3， N8， and N9 were clustered into one category， and the rest were clustered into one category; S1， S3， S6， and S9 were grouped together， and the rest were grouped together. The results unsupervised model of PCA showed that the cumulative variance contribution rate of the first two principal component factors was 87.20%. Supervised model of OPLS-DA showed that schizandrin A， schisandraol A， schisantherin A and schisandrin B were the differential markers that affected the quality of S. sphenanthera and S. chinensis（VIPs were 2.29， 2.24，1.73，1.48， respectively）. CONCLUSIONS： The established fingerprint is accurate， scientific， simple and easy to use， combined with multivariate statistical analysis can be used to evaluate the quality of S. sphenantherae and S. chinensis. The components of S. sphenanthera and S. chinensis were different， schisanolrin A is differential marker.

KEYWORDS? ?Schisandra sphenanthera; Schisandra chinensis; HPLC; Fingerprint; HCA; PCA; OPLS-DA; Differential markers

五味子為木蘭科植物五味子[Schisandra chinesis （Turcz.） Baill.]的干燥成熟果實，習稱“北五味子”;南五味子為木蘭科植物華中五味子（S. sphenanthera Rehd. et Wils.）的干燥成熟果實。兩者在2015年版《中國藥典》（一部）中均有記載，其質量標準雖有不同，但性味、歸經、功能主治的表述卻完全相同[1]。歷代本草典籍中，有關兩種五味子的產地、名稱、功效等記載不一，如《本草圖經》中記載，“五味子，生齊山山谷及代郡，今河東、陜西州郡尤多，而杭越間亦有”[2]。根據其產地查閱《中藥材產銷》[3]可推斷，此處“齊山山谷及代郡”為北五味子產區(qū)，“河東、陜西州郡、杭越”為南五味子產區(qū)，由此可見兩種五味子在產區(qū)分布上存在差異。《本草蒙筌》中記載，“南北各有所長，藏留切勿相混，風寒咳嗽南五味為奇，虛損勞傷北五味最妙”[4];《本草綱目》中記載，“五味，今有南北之分，南產者，色紅;北產者，色黑，入滋補藥必用北產者乃良”[5]。由此可知，南、北五味子在功效、名稱、性狀等方面的記載也不盡相同，其中北五味子質量較優(yōu)。

隨著現代研究的深入，南、北五味子藥材間的鑒別技術不斷優(yōu)化，除常見的性狀、顯微、薄層色譜鑒別等外[6-8]，還有DNA條形碼技術等鑒定手段[9]。由于南、北五味子藥材產地較多，在現代臨床應用中普遍存在混用的現象[10];加之學者對兩者的認知存在一些偏差，故常將南五味子視為五味子的偽品[11]。因此，如何正確區(qū)分南、北五味子，并對其進行準確鑒別并發(fā)掘不同功效的物質基礎對確保臨床療效具有重要的意義。

南、北五味子的化學成分有所不同，李昕等[12]采用氣質聯用法（GC-MS）對南、北五味子揮發(fā)油化學成分進行鑒定，結果發(fā)現北五味子中的依蘭烯含量高于南五味子;李曉亮等[13]建立了南、北五味子醇提物的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，并發(fā)現南五味子中五味子酯甲、五味子甲素的含量相對較高，而北五味子中五味子醇甲的含量相對較高，但未深入挖掘兩種五味子指紋圖譜中涵蓋的化學信息，也未篩選出導致南、北五味子差異的標志性成分。

中藥化學成分的復雜性和多樣性是其發(fā)揮療效的基礎，亦是評價藥材質量的難點和重點[14]。指紋圖譜可完整、系統(tǒng)地表征藥材樣品中主要化學成分的相似性特征[15];化學模式識別可鑒別藥材樣品間的差異，以綜合評估中藥質量[16-17]?；诖耍狙芯糠謩e建立了南、北五味子藥材的HPLC指紋圖譜，并結合相似度評價、聚類分析（HCA）、無監(jiān)督模式主成分分析（PCA）、有監(jiān)督模式正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）篩選影響南、北五味子藥材質量的差異標志物，以期為其質量控制及藥效研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC 20AD型HPLC儀（包括二元泵、可制冷自動進樣器、二極管陣列檢測器、柱溫箱、Labsulotions Version 5.87色譜工作站）、AUW-120D型十萬分之一電子天平均購自日本Shimadzu公司;1260型HPLC儀（包括四元泵、紫外檢測器、柱溫箱、自動進樣器、Open LABA.01.05色譜工作站）購自美國Agilent公司;DHG-9070 型電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）;SB25-12D型超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）;5810R型高速離心機（德國Eppendorf公司）;Milli-Q超純水機（美國Millipore公司）;FW-80型微型高速萬能試樣粉碎機（天津市靜?？h工興電器廠）。

1.2 藥品與試劑

五味子醇甲對照品（批號：MUST-19031905，純度：99.46%）、五味子醇乙對照品（批號：MUST-19042307，純度：99.88%）、五味子酯甲對照品（批號：MUST- 19062302，純度：99.38%）、五味子甲素對照品（批號：MUST-19092908，純度：99.35%）均購自成都曼斯特生物科技有限公司;五味子乙素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110765-201512，純度：99.00%）;乙腈為色譜純，甲醇為分析純，水為超純水。

南、北五味子藥材各10批（編號分別為N1～N10、S1～ S10），分別購自全國部分連鎖藥店、醫(yī)藥公司及藥材市場，經鄭州大學藥學院賈陸教授鑒定為木蘭科植物五味子[S. chinensis （Turcz.） Baill.]的干燥成熟果實、木蘭科植物華中五味子（S. sphenanthera Rehd. et Wils.）的干燥成熟果實。藥材樣品信息來源見表1。

2 方法與結果

2.1 南、北五味子HPLC指紋圖譜的建立

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Aglient Zobax SB C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m）;流動相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～5 min，51%A;5～20 min，51%A→60%A;20～35 min，60%A;35～40 min，60%A→85%A;40～45 min，85%A;45～48 min，85%A→51%A）;流速：0.8 mL/min;檢測波長：220 nm;柱溫：30 ℃;進樣量：5 ?L。

2.1.2 供試品溶液的制備 稱取南、北五味子藥材，粉碎，過三號篩。精密稱定上述粉末各1.00 g，分別置于50 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20 mL，稱定質量，超聲（功率：250 W，頻率：20 kHz）提取20 min，放冷，再次稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，以12 000 r/min離心10 min，取上清液[14]，即得。

2.1.3 混合對照品溶液的制備 精密稱取五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素對照品4.06、4.02、4.52、4.48、3.74 mg，分別置于2 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，依次取880、248、40、1 152、336 ?L，置于2 mL量瓶中，混勻，作為混合對照品母液;精密吸取上述混合對照品母液適量，加甲醇稀釋，制成上述各成分質量濃度分別為133.79、3.75、6.76、193.05、21.79 ?g/mL的混合對照品溶液。

2.1.4 精密度試驗 取“2.1.2”項下供試品溶液（編號：S2）適量，按“2.1.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次。以五味子甲素為參照（S），記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果，33個共有峰相對保留時間的RSD均不低于0.30%（n=6），相對峰面積的RSD均不低于1.33%（n=6），表明方法精密度良好。

2.1.5 重復性試驗 取同一批藥材樣品粉末（編號：S2）1.00 g，共6份，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，以五味子甲素為參照（S），記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果，33個共有峰相對保留時間的RSD均不低于0.37%（n=6），相對峰面積的RSD均不低于2.10%（n=6），表明方法重復性良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗 取“2.1.2”項下供試品溶液（編號：S2）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、16、24 h時按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，以五味子甲素為參照（S），記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果，33個共有峰相對保留時間的RSD均不低于0.10%（n=6），相對峰面積的RSD均不低于2.10%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內穩(wěn)定性良好。

2.1.7 HPLC指紋圖譜的建立 取南、北五味子藥材樣品各10批，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。將所得色譜數據（“AIA”格式）導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》，采用中位數法，設定時間窗為0.10 min，經多點校正完成匹配后，生成指紋圖譜共有模式，并以此作為對照指紋圖譜（R）。結果，北五味子有33個共有峰，南五味子有32個共有峰，詳見圖1、圖2。

2.1.8 相似度評價 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》，對南、北五味子藥材樣品的指紋圖譜及其對照指紋圖譜進行相似度評價。結果，N1～N10藥材樣品的相似度均大于0.97，相似度良好，表明不同批次南五味子藥材的質量較穩(wěn)定;S1～S10藥材樣品的相似度均大于0.99，相似度良好，表明不同批次北五味子藥材的質量均一穩(wěn)定，詳見表2。南、北五味子對照指紋圖譜的相似度為0.50，表明南、北五味子的質量存在明顯差異。

2.1.9 共有特征峰的指認 根據南、北五味子藥材的HPLC指紋圖譜生成結果，選擇圖譜中含量較高且分離度較好的色譜峰作為共有特征峰。結果，南、北五味子共有19個共有特征峰，通過與混合對照品的保留時間和HPLC色譜圖（見圖3）進行對比，共指認出其中的5個，分別為五味子醇甲（2號峰）、五味子醇乙（3號峰）、五味子酯甲（9號峰）、五味子甲素（13號峰）、五味子乙素（16號峰）。因五味子甲素含量相對較高，分離度較好，且出峰穩(wěn)定，故以其為參照（S）計算其他共有特征峰的相對保留時間和相對峰面積。結果，20批樣品各共有特征峰相對保留時間的RSD均不低于0.22%，表明南、北五味子的主要有效成分相似;其相對峰面積的RSD相差較大（1.26%～140.21%），表明南、北五味子主要有效成分的含量存在差異。

2.2 HCA

采用相似度評價雖然能夠很好地反映南、北五味子藥材指紋圖譜的相似程度，但不能體現成分含量的高低，而化學模式識別可對量的差別進行分析[18]。HCA是一種通過數據建模簡化多維數據，將具有指標性的數據進行聚類并劃分為相對同質的群組的統(tǒng)計分析技術[19]。以20批南、北五味子的19個共有特征峰峰面積為變量，借助SPSS 20.0軟件，采用組間聯接法以歐氏平方距離為區(qū)間進行HCA，結果見圖4。

由圖4可知，南、北五味子20批樣品可聚為兩大類，N1～N10聚為一類，S1～S10聚為一類。其中，N1、N3、N8、N9聚為一類，N2、N4～N7、N10聚為一類;S2、S4、S5、S7、S8、S10聚為一類，S1、S3、S6、S9聚為一類。這提示不同批次五味子藥材樣品質量存在差異。

2.3 PCA

PCA可快速表征樣本的差異信息[20]。以19個共有特征峰的相對峰面積為變量，采用SPSS 20.0軟件進行PCA，結果見表3。

2.4 OPLS-DA

以19個共有特征峰相對峰面積為多元變量，采用SIMCA 14.1軟件進行有監(jiān)督模式的OPLS-DA[22]。結果，累積解釋能力參數（R2X）為0.917，累積解釋能力參數（R2Y）為0.985，預測能力參數（Q2）為0.952，均大于0.5，表明該模型預測能力好，可用于區(qū)別南、北五味子藥材，詳見圖6。

為了進一步檢驗樣本分類是否有效或樣本間是否有差異，提取OPLS-DA模型中的19個變量，采用SIMCA 14.1軟件對所建OPLS-DA模型進行200次的置換檢驗，得到OPLS-DA/S-plot圖，詳見圖7（該圖中，S型曲線上的每個點各代表1個化合物，差異性化合物分布在S型曲線的上下端[23]）。

由圖7可知，右上端表示南五味子藥材中峰面積較大的化合物，包括9號峰（五味子酯甲）和13號峰（五味子甲素）;左下端表示北五味子藥材中峰面積較大的化合物，分別為2號峰（五味子醇甲）和16號峰（五味子乙素）。

變量重要性投影（VIP）可衡量各共有特征峰的表達模式對樣本分類判別的影響強度和解釋能力，從而輔助篩選質量差異標志物[24]。當VIP值>1.0時，表明該變量對所建模型的貢獻度高于平均水平[25-26]，因此本研究以VIP值>1.0為標準篩選質量差異標志物。結果，共得到4個VIP值大于1的共有特征峰，分別為13號峰（五味子甲素，VIP值為2.29）、2號峰（五味子醇甲，VIP值為2.24）、9號峰（五味子酯甲，VIP值為1.73）和16號峰（五味子乙素，VIP值為1.48）。這提示上述4個成分為影響南、北五味子藥材質量的差異標志性成分，詳見圖8。

3 討論

本研究試驗前期采用二極管陣列檢測器進行了190～800 nm全波長掃描。結果發(fā)現，在220 nm波長處所得指紋圖譜的色譜峰信息較為全面，可識別的化合物種類也較豐富，故選擇220 nm作為檢測波長。隨后，對乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-水等不同流動相體系的分離效果進行了比較。結果發(fā)現，以乙腈-水為流動相進行梯度洗脫時，各色譜峰的峰形佳且流動相配制簡單，故選擇乙腈-水為流動相。同時，又考察了不同流速（0.8、1.0、1.2 mL/min）的分離效果。結果發(fā)現，當流速為0.8 mL/min時，色譜峰峰形和分離度均較好，故選擇流速為0.8 mL/min。

本研究采用HPLC法分別建立了南、北五味子藥材的指紋圖譜。結果顯示，南、北五味子指紋圖譜中分別有32、33個共有峰。選擇指紋圖譜中含量較高且分離度較好的色譜峰作為共有特征峰，共標定出19個共有特征峰;通過與混合對照品指認，共鑒別出其中的5個，分別為五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素。

本研究采用HCA、PCA法對南、北五味子藥材進行分類。結果顯示，20批樣品可聚為兩類，N1～N10聚為一類，S1～S10聚為一類。其中，N1、N3、N8、N9聚為一類，N2、N4～N7、N10聚為一類;S2、S4、S5、S7、S8、S10聚為一類，S1、S3、S6、S9聚為一類。PCA結果與HCA結果一致。為進一步表征兩者的差異，本研究采用OPLS-DA法共篩選出了4個影響南、北五味子藥材質量的差異標志物，分別為五味子甲素、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子乙素。

綜上所述，所建HPLC指紋圖譜準確、科學、簡便易行，結合多元統(tǒng)計分析可用于評價南、北五味子藥材的質量。兩種藥材質量的差異標志物為五味子甲素等4種成分。

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（收稿日期：2020-05-11 修回日期：2020-07-06）

（編輯：陳 宏）