李錦英 張兆萍 葉金飛 曾麗華 梁蘊(yùn)儀 朱玲

摘 要 目的：探討菟絲子-枸杞子藥對(duì)治療卵巢早衰的潛在作用機(jī)制。方法：利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)（TCMSP）、GenenCards和OMIM數(shù)據(jù)庫獲得菟絲子-枸杞子藥對(duì)活性成分及卵巢早衰的相關(guān)靶點(diǎn)，利用Venn在線工具篩選兩者的交集基因，并采用Cytoscape 3.7.0軟件構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)和靶點(diǎn)間蛋白-蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò);通過DAVID數(shù)據(jù)庫對(duì)交集基因進(jìn)行基因本體（GO）富集分析和KEGG通路富集分析，最終構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)-關(guān)鍵通路網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果：篩選出菟絲子-枸杞子藥對(duì)活性成分42個(gè)，成分及疾病靶點(diǎn)231、1 913個(gè)，節(jié)點(diǎn)度值排名靠前的化合物有槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、異鼠李素、黃豆黃素、豆甾醇和芝麻素等?；钚猿煞职悬c(diǎn)與卵巢早衰疾病靶點(diǎn)的交集基因共149個(gè)，交集基因的PPI網(wǎng)絡(luò)共包含節(jié)點(diǎn)149個(gè)、邊2 970條，平均節(jié)點(diǎn)度值為39.9，平均介數(shù)值為0.005 4。GO分析結(jié)果顯示，上述交集基因的分子功能主要包括蛋白結(jié)合、酶結(jié)合等，生物過程主要涉及促進(jìn)RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄、促進(jìn)DNA轉(zhuǎn)錄等，細(xì)胞組分主要包括細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)等，信號(hào)通路主要涉及癌癥信號(hào)通路、乙型肝炎通路、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信號(hào)通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路等?；钚猿煞?靶點(diǎn)-關(guān)鍵通路網(wǎng)絡(luò)顯示，菟絲子和枸杞子的主要活性成分均為黃酮類及醇類，關(guān)鍵靶點(diǎn)有蛋白激酶B1（AKT1）、腫瘤抑制蛋白P53（TP53）、白細(xì)胞介素6（IL6）、腫瘤壞死因子（TNF）等，通路主要涉及癌癥信號(hào)通路、乙型肝炎信號(hào)通路、PI3K/AKT信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等。結(jié)論：菟絲子-枸杞子藥對(duì)的多種活性成分可能通過PI3K/AKT信號(hào)通路、MAPK等多條通路作用于AKT1、TP53等多個(gè)靶點(diǎn)治療卵巢早衰，并挖掘出潛在活性成分豆甾醇、芝麻素以及潛在靶點(diǎn)IL6、TNF。

關(guān)鍵詞 菟絲子-枸杞子藥對(duì);卵巢早衰;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);作用機(jī)制

中圖分類號(hào) R285;R711.75 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2020）18-2202-08

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.18.05

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To investigate the potential mechanism of couplet medicine of Cuscutae Semen-Lycii Fructus in the treatment of premature ovarian failure. METHODS： Main active components and related targets of couplet medicine of Cuscutae Semen-Lycii Fructus in the treatment of premature ovarian failure were obtained from TCMSP， GeneCards and OMIM database. The intersection genes between them were screened using Venn online tool. Cytoscape 3.7.0 software was adopted to establish the active ingredients-target network and the PPI network. GO and KEGG pathway enrichment analysis on intersection genes were carried out by DAVID database. Finally， an active component-target-key pathway network was constructed. RESULTS： Totally 42 active components， 231 and 1 913 targets for active components and disease were obtained from couplet medicine of Cuscutae Semen-Lycii Fructus. The components with high node degree included quercetin，kaempferol，β-sitosterol，isorhamnetin，glycitein，stigmasterol and sesamin，etc.? There were 149 intersection genes between the active component targets and premature ovarian failure targets. PPI network contained 149 nodes and 2 970 edges，with an average node degree of 39.9 and an average medium of 0.005 4. The results of GO analysis showed that molecule function of the above-mentioned genes mainly involved protein binding，enzyme binding， etc. Biological process mainly included that positive regulation of transcription from RNA polymerase Ⅱ promoter，positive regulation of transcription DNA-templated， etc. Cell components mainly included nucleus，cytoplasm，etc. Signaling pathway mainly involved cancer signaling pathway， hepatitis B signling pathway， PI3K/AKT signaling pathway，MAPK signaling pathway，etc. The results of active component-target-key pathway network showed that active components of Cuscutae Semen and Lycii Fructus were flavonoids and alcohols; key target included AKT1，TP53，VEGFA，IL6，TNF，etc. Signaling pathway mainly involved cancer signaling pathway， hepatitis B signaling pathway，PI3K/AKT signaling pathway，MAPK signaling pathway，etc. CONCLUSIONS： Through PI3K/AKT signaling pathway and MAPK signaling pathway，the active components of couplet medicine of Cuscutae Semen-Lycii Fructus may act on AKT1，TP53 and other targets，and then play a therapeutic role on premature ovarian failure. The Potential active components stigmasterol， sesamin and potential targets IL6， TNF were found.

KEYWORDS? ?Couplet medicine of Cuscutae Semen-Lycii Fructus; Premature ovarian failure;Network pharmacology;Mechanism of action

卵巢早衰（Premature ovarian failure）是臨床上常見的生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病，是指女性在40歲以前出現(xiàn)卵巢儲(chǔ)備功能下降甚至衰竭的現(xiàn)象，臨床主要表現(xiàn)為閉經(jīng)、不孕、低雌激素癥等，部分患者還可出現(xiàn)潮熱多汗、煩躁不安、性欲低下、睡眠障礙、骨質(zhì)疏松等圍絕經(jīng)期癥狀[1]。據(jù)調(diào)查，我國(guó)卵巢早衰的發(fā)病率為1%～3%[2]，是臨床婦科醫(yī)師關(guān)注的熱點(diǎn)之一?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療卵巢早衰主要有雌孕激素替代療法、免疫療法以及誘導(dǎo)排卵、卵巢冷凍移植等對(duì)癥治療方法[3]。而中醫(yī)認(rèn)為，卵巢早衰屬“閉經(jīng)”“不孕”“血枯”等范疇，病機(jī)總歸腎虛，治療當(dāng)以補(bǔ)腎填精為主[4]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是藥理學(xué)的分支學(xué)科，其是在藥物、靶點(diǎn)、疾病相互作用的基礎(chǔ)上，通過網(wǎng)絡(luò)分析和生物信息技術(shù)等手段系統(tǒng)揭示多成分藥物治療疾病的相關(guān)機(jī)制[5]。該學(xué)科注重整體性、系統(tǒng)性和藥物之間的相互作用，這與中醫(yī)治病的整體觀念相吻合。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與中藥研究的結(jié)合，可為闡明中醫(yī)藥治療疾病的作用機(jī)制提供新的研究思路和方法，有利于揭示中藥治病的本質(zhì)，并為中藥研發(fā)提供強(qiáng)有力的理論支撐，進(jìn)而推動(dòng)中醫(yī)藥現(xiàn)代化的發(fā)展[6]。

菟絲子-枸杞子藥對(duì)為左歸丸、歸腎丸、五子衍宗丸等治療卵巢早衰方劑的核心藥對(duì)，具有補(bǔ)腎填精的作用，臨床上多用菟絲子-枸杞子藥對(duì)治療腎虛型卵巢早衰，療效確切[7]。但菟絲子-枸杞子藥對(duì)治療卵巢早衰的作用靶點(diǎn)及分子機(jī)制等尚不明確。為此，本研究擬借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法探討該藥對(duì)治療卵巢早衰的潛在作用機(jī)制，旨在為臨床應(yīng)用菟絲子-枸杞子藥對(duì)治療卵巢早衰提供基礎(chǔ)生物學(xué)信息支撐。

1 資料與方法

1.1 菟絲子-枸杞子藥對(duì)活性成分及靶點(diǎn)蛋白的篩選

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php），以“Tu Si Zi”或“Cuscutae Semen”等為關(guān)鍵詞搜索菟絲子的主要化學(xué)成分，以“Gou Qi Zi”或“Lycii Fructus”等為關(guān)鍵詞搜索枸杞子的主要化學(xué)成分;以口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18為限定條件初步篩選其活性化合物，去除無明確作用靶點(diǎn)的成分后獲得活性成分。同時(shí)，提取其蛋白質(zhì)靶點(diǎn)。此外，為標(biāo)準(zhǔn)化靶點(diǎn)蛋白信息，統(tǒng)一將靶點(diǎn)蛋白轉(zhuǎn)化成Uniprot數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）的靶點(diǎn)。

1.2 卵巢早衰相關(guān)靶點(diǎn)的篩選

在 GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）和OMIM數(shù)據(jù)庫（http：//www.omim.org）中以“Premature ovarian failure”O(jiān)R“POF”為關(guān)鍵詞檢索與卵巢早衰疾病相關(guān)的靶點(diǎn)基因，并記錄靶點(diǎn)基因的Score值（Score值越高代表靶點(diǎn)與疾病之間的關(guān)系越緊密）;依據(jù)文獻(xiàn)經(jīng)驗(yàn)[8]，若疾病靶點(diǎn)過多，則將Score值大于中位值的目標(biāo)靶點(diǎn)作為卵巢早衰的潛在靶點(diǎn)。合并各數(shù)據(jù)庫的檢索結(jié)果，刪去重復(fù)值后獲得卵巢早衰靶點(diǎn)。

1.3 主要活性成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

為明確菟絲子-枸杞子藥對(duì)活性成分靶點(diǎn)與卵巢早衰疾病靶點(diǎn)間的關(guān)系，利用Venn在線工具（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）繪制韋恩圖，獲得菟絲子-枸杞子藥對(duì)活性成分靶點(diǎn)與卵巢早衰靶點(diǎn)的交集基因。將藥材活性成分靶點(diǎn)與交集基因通過Cytoscape 3.7.0軟件構(gòu)建活性成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。以節(jié)點(diǎn)表示活性成分和靶點(diǎn)，節(jié)點(diǎn)之間的以邊相連;節(jié)點(diǎn)度值表示與節(jié)點(diǎn)相連邊的數(shù)量，其值越大，表示該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中越重要（下同）。

1.4 交集基因蛋白-蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將交集基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org），生物種類設(shè)定為“Homo sapiens”，最小相互作用閾值設(shè)定為“Highest confidence>0.9”，其余設(shè)置均為默認(rèn)，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，并通過Cytoscape 3.7.0軟件進(jìn)行可視化展示。

1.5 交集基因的富集分析

為闡明菟絲子-枸杞子藥對(duì)治療卵巢早衰潛在靶點(diǎn)在信號(hào)通路中的作用，采用DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）對(duì)交集基因進(jìn)行基因本體（GO）富集分析和KEGG通路富集分析。限定物種為“Homo sapiens（人）”，標(biāo)識(shí)符（Identifier）設(shè)置為“Official gene symbol（官方名稱）”，設(shè)定P<0.001（P值反映生物功能的顯著性及通路的富集程度，P值越小，則富集結(jié)果顯著性越高）。將通路P值由小到大排序，并將富集結(jié)果導(dǎo)入微生信在線作圖平臺(tái)（http：//www.bioinformatics.com.cn/）中進(jìn)行可視化展示。

1.6 活性成分-靶點(diǎn)-關(guān)鍵通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將前10條關(guān)鍵通路與菟絲子-枸杞子藥對(duì)的活性成分、潛在作用靶點(diǎn)相對(duì)應(yīng)，并通過Cytoscape 3.7.0軟件構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)-關(guān)鍵通路網(wǎng)絡(luò)，直觀地展現(xiàn)菟絲子-枸杞子藥對(duì)治療卵巢早衰的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，闡釋該藥對(duì)治療卵巢早衰的潛在作用機(jī)制。

2 結(jié)果

2.1 菟絲子-枸杞子藥對(duì)活性成分篩選結(jié)果

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索共獲得菟絲子活性成分10種、枸杞子活性成分35種，合并去重后共獲得活性成分42種，詳見表1。菟絲子作用靶點(diǎn)蛋白343個(gè)，枸杞子作用靶點(diǎn)蛋白364個(gè)，合并去重經(jīng)Uniprot數(shù)據(jù)庫標(biāo)準(zhǔn)化后得到靶點(diǎn)蛋白231個(gè)。

2.2 卵巢早衰相關(guān)靶點(diǎn)檢索結(jié)果

從GeneCards數(shù)據(jù)庫共獲得卵巢早衰相關(guān)靶點(diǎn)基因3 830個(gè)，其Score最大值為201.03、最小值為0.24，中位數(shù)為4.39，故設(shè)定Score>4.39的靶點(diǎn)為卵巢早衰的潛在靶點(diǎn)，結(jié)合OMIM數(shù)據(jù)庫補(bǔ)充相關(guān)靶點(diǎn)信息，合并去重后最終獲得卵巢早衰疾病靶點(diǎn)1 913個(gè)。

2.3 主要活性成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的分析結(jié)果

共獲得菟絲子-枸杞子藥對(duì)活性成分靶點(diǎn)與卵巢早衰靶點(diǎn)的交集基因149個(gè)，韋恩圖見圖1。將上述交集基因?qū)隒ytoscape 3.7.0軟件中，構(gòu)建活性成分-卵巢早衰靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，詳見圖2。由圖2可見，該網(wǎng)絡(luò)含節(jié)點(diǎn)193個(gè)，其中藥材節(jié)點(diǎn)2個(gè)、活性成分節(jié)點(diǎn)42個(gè)、靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)149個(gè)，成分與靶點(diǎn)之間邊507條;活性成分平均節(jié)點(diǎn)度值為12.071 4，大于平均節(jié)點(diǎn)度值的活性成分有7個(gè)。其中，菟絲子和枸杞子共有活性成分槲皮素節(jié)點(diǎn)度值最大，為238，預(yù)測(cè)槲皮素為菟絲子-枸杞子藥對(duì)治療卵巢早衰的主要活性成分;其次為山柰酚（菟絲子）、β-谷甾醇（菟絲子和枸杞子共有）、異鼠李素（菟絲子）、黃豆黃素（枸杞子）和豆甾醇（枸杞子）、芝麻素（菟絲子）。

2.4 菟絲子-枸杞子藥對(duì)活性成分與卵巢早衰交集基因PPI網(wǎng)絡(luò)的分析結(jié)果

菟絲子-枸杞子藥對(duì)活性成分與卵巢早衰交集基因的PPI網(wǎng)絡(luò)圖見圖3。由圖3可見，該網(wǎng)絡(luò)含節(jié)點(diǎn)149個(gè)與邊2 970條，平均節(jié)點(diǎn)度值為39.9，平均介數(shù)值為0.005 4。菟絲子-枸杞子藥對(duì)可能通過蛋白激酶B1（AKT1）、腫瘤抑制蛋白P53（TP53）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（VEGFA）、白細(xì)胞介素6（IL6）、腫瘤壞死因子（TNF）、胱天蛋白酶3（CASP3）等關(guān)鍵靶點(diǎn)發(fā)揮治療卵巢早衰的作用。

2.5 交集基因的富集分析結(jié)果

將交集基因?qū)隓AVID 生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行GO分析，共得到GO條目247個(gè)（P<0.001），其中分子功能39個(gè)、生物過程185個(gè)、細(xì)胞組分23個(gè)，主要涉及蛋白結(jié)合、促進(jìn)RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄等，且主要集中在細(xì)胞核，其中分子功能、生物過程、細(xì)胞組分富集基因數(shù)排序前10位的GO分析結(jié)果見表2～表4。KEGG通路富集分析共篩選出信號(hào)通路87條（P<0.001），主要涉及癌癥信號(hào)通路、乙型肝炎信號(hào)通路、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信號(hào)通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路、叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O亞族（FoxO）信號(hào)通路等，詳見圖4。

2.6 成分-靶點(diǎn)-關(guān)鍵通路網(wǎng)絡(luò)的分析結(jié)果

將關(guān)鍵通路與“菟絲子-枸杞子”藥對(duì)的活性成分、潛在作用靶點(diǎn)一一對(duì)應(yīng)，構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)-關(guān)鍵通路網(wǎng)絡(luò)，詳見圖5。由圖5可見，菟絲子-枸杞子藥對(duì)治療卵巢早衰涉及多個(gè)活性成分、靶點(diǎn)及通路。主要活性成分有菟絲子中的黃酮類及醇類，枸杞子中的黃酮類及醇類，主要靶點(diǎn)有AKT1、TP53、VEGFA、IL6、TNF、CASP3等，通路主要涉及癌癥信號(hào)通路、乙型肝炎信號(hào)通路、PI3K/AKT信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路等。

3 討論

菟絲子-枸杞子藥對(duì)是中醫(yī)臨床治療卵巢早衰的常用藥對(duì)，具有補(bǔ)腎填精、調(diào)節(jié)腎陰陽平衡的功效，是左歸丸、歸腎丸、五子衍宗丸的核心藥對(duì)[7，9]?，F(xiàn)代藥理研究顯示，菟絲子的主要藥理作用包括增強(qiáng)免疫力、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)、增加冠脈血流量、降血糖、抗氧化和抗衰老等[10]，枸杞子的主要藥理作用包括提高免疫力、抗氧化、抗衰老、保護(hù)神經(jīng)、降壓、降血糖、抗腫瘤等[11]。菟絲子-枸杞子配伍的現(xiàn)代研究表明，二者配伍可以治療卵巢早衰、更年期綜合征、不孕不育等疾病[7]。陳雯玥等[12]利用中醫(yī)傳承輔助平臺(tái)對(duì)270個(gè)治療卵巢早衰方劑組方藥材的用藥頻次進(jìn)行分析，結(jié)果菟絲子和枸杞子在處方中出現(xiàn)頻次分別位居3、4位，可見菟絲子和枸杞子在卵巢早衰臨床治療中具有重要意義。目前，菟絲子-枸杞子藥對(duì)配伍作用于卵巢早衰的藥理學(xué)研究報(bào)道較少，因此本研究對(duì)菟絲子-枸杞子藥對(duì)治療卵巢早衰的潛在作用機(jī)制進(jìn)行了深入分析。

3.1 菟絲子-枸杞子藥對(duì)活性成分與靶點(diǎn)分析

本研究共篩選出菟絲子-枸杞子藥對(duì)潛在活性化合物42個(gè)，其中部分化合物已通過研究證實(shí)其具有保護(hù)卵巢的作用。例如，王永霞等[13]研究表明，菟絲子總黃酮具有類雌激素樣活性，可以改善下丘腦-垂體促性腺功能和卵巢內(nèi)分泌功能，促進(jìn)卵泡發(fā)育，增加卵巢激素受體的數(shù)量，對(duì)改善模型大鼠的卵巢早衰有很好的效果。槲皮素能促進(jìn)各級(jí)卵泡生長(zhǎng)發(fā)育，增加顆粒細(xì)胞的雌激素分泌并促進(jìn)其正常增殖，有效地改善卵巢功能[14]。β-谷甾醇具有雌激素樣活性，可促進(jìn)卵巢顆粒細(xì)胞產(chǎn)生雌激素，對(duì)卵巢早衰致骨代謝失衡具有協(xié)同調(diào)節(jié)作用[15]。在活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建中，菟絲子-枸杞子藥對(duì)活性成分中節(jié)點(diǎn)度值較高的化合物有槲皮素、異鼠李素、山柰酚、β-谷甾醇、芝麻素、黃豆黃素、豆甾醇等，表明這幾種化合物在保護(hù)卵巢功能中起著主要的作用，可能是菟絲子-枸杞子藥對(duì)治療卵巢早衰的有效成分。但目前對(duì)于這幾種有效成分的相關(guān)作用機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步深入研究。通過PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建可以發(fā)現(xiàn)，菟絲子-枸杞子藥對(duì)可能通過AKT1、TP53、CASP3等關(guān)鍵靶點(diǎn)發(fā)揮治療卵巢早衰的作用，且結(jié)合GO富集分析、KEGG通路富集分析以及活性成分-靶點(diǎn)-關(guān)鍵通路網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)靶點(diǎn)涉及多種生物過程和信號(hào)通路與卵巢早衰的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。目前已有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，AKT1是PI3K/AKT信號(hào)通路中重要的下游靶激酶，參與了細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)控，當(dāng)AKT1正常表達(dá)時(shí)，可以維持原始卵泡正常的生長(zhǎng)發(fā)育，可以調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)和顆粒細(xì)胞的增殖分化，并可抑制細(xì)胞凋亡;當(dāng)AKT1表達(dá)異常時(shí)，則會(huì)使原始卵泡生長(zhǎng)發(fā)育失常，導(dǎo)致卵巢發(fā)生病理性改變，從而加速卵巢衰老的進(jìn)程[16]。TP53也與卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡和增殖密切相關(guān)[17]。CASP3是CASP家族中的一個(gè)凋亡效應(yīng)子，在卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)胞中均有表達(dá)，主要參與細(xì)胞凋亡過程，當(dāng)CASP3系統(tǒng)被激活時(shí)可觸發(fā)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而加速卵巢早衰[18]?？梢?，菟絲子-枸杞子藥對(duì)可能通過調(diào)節(jié)以上主要靶點(diǎn)而發(fā)揮治療卵巢早衰的作用。

3.2 菟絲子-枸杞子藥對(duì)GO生物過程分析

通過GO富集分析發(fā)現(xiàn)，菟絲子-枸杞子藥對(duì)治療卵巢早衰涉及多種分子功能、生物過程和細(xì)胞組分。生物過程主要涉及促進(jìn)RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、氧化還原過程、炎癥反應(yīng)、促進(jìn)細(xì)胞增殖、凋亡過程等。其中，凋亡過程與卵巢早衰的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，當(dāng)卵母細(xì)胞DNA受到損傷時(shí)，下游信號(hào)分子促凋亡基因被激活，可誘發(fā)細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，直接或間接使卵巢儲(chǔ)備功能下降[19]。氧化還原過程也在卵巢早衰的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用，某些化療藥物可以使活性氧增加，可能是由PI3K/AKT等信號(hào)通路介導(dǎo)產(chǎn)生，活性氧不僅可通過激活卵泡凋亡信號(hào)、上調(diào)凋亡蛋白和下調(diào)抑凋亡蛋白表達(dá)、破壞細(xì)胞微管結(jié)構(gòu)和染色體排列來降低卵母細(xì)胞的質(zhì)量，加速卵母細(xì)胞老化，還可以對(duì)線粒體脂質(zhì)、脫氧核糖核酸和蛋白質(zhì)造成氧化損傷，當(dāng)線粒體受損時(shí)，可以觸發(fā)線粒體自噬途徑，受損的線粒體向胞質(zhì)釋放高水平的鈣和細(xì)胞色素C，最終引起顆粒細(xì)胞凋亡或死亡[20-21]。與卵巢早衰相關(guān)的微小RNA（miRNA）的上調(diào)與下調(diào)對(duì)卵巢早衰的形成具有一定的作用[22]，并逐漸成為潛在的治療靶點(diǎn)。在卵巢中miRNA的廣泛表達(dá)在卵泡成熟過程中具有重要的作用，已有實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，西洋參能夠通過增加miR-29a和miR-144水平來調(diào)節(jié)前列腺素的生物合成，以調(diào)節(jié)排卵、預(yù)防卵巢衰老，從而保護(hù)卵巢功能[23]。此外，有研究表明，卵巢早衰患者中IL6等炎癥因子水平較高，可通過降低卵巢炎癥反應(yīng)、降低血清中炎癥因子水平從而達(dá)到改善卵巢功能的目的[24-25]。以上均表明，菟絲子-枸杞子藥對(duì)治療卵巢早衰可能涉及了多種復(fù)雜的生物過程。

3.3 關(guān)鍵通路的相關(guān)機(jī)制分析

PI3K/AKT信號(hào)通路是卵巢早衰的重要通路之一，該通路與多種疾病發(fā)生有關(guān)，主要參與調(diào)節(jié)原始卵泡的發(fā)育、顆粒細(xì)胞的增殖分化、卵母細(xì)胞生長(zhǎng)等過程，該通路中各信號(hào)分子表達(dá)異常會(huì)導(dǎo)致原始卵泡生長(zhǎng)發(fā)育受限，阻礙顆粒細(xì)胞增殖分化，進(jìn)而導(dǎo)致卵巢功能下降。FoxO信號(hào)通路為PI3K/AKT通路下游眾多通路中的一條，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，PI3K表達(dá)上調(diào)并激活A(yù)KT時(shí)，可以促進(jìn)FoxO3a磷酸化并喪失轉(zhuǎn)錄活性，導(dǎo)致原始卵泡池過度激活，使卵巢原始卵泡和初級(jí)卵泡減少、卵巢纖維化、髓質(zhì)破壞和卵巢萎縮，從而降低卵巢儲(chǔ)備[26]。有研究表明，中藥復(fù)方新加歸腎丸可以通過增強(qiáng)PI3K/AKT信號(hào)通路的活性，從而促進(jìn)卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育和顆粒細(xì)胞的增殖，抑制卵泡的過度閉鎖，修復(fù)卵巢功能[27]。PI3K/AKT下游的哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）對(duì)卵泡的調(diào)節(jié)起重要作用，mTOR活化水平下降則會(huì)阻礙卵泡生長(zhǎng)發(fā)育;此外，過度活化的mTOR也會(huì)加速原始卵泡顆粒細(xì)胞的分化，過早激活休眠卵母細(xì)胞和原始卵泡，導(dǎo)致卵泡池過度耗竭，從而加速卵巢早衰[28]。進(jìn)一步驗(yàn)證PI3K/AKT信號(hào)通路在卵巢早衰中具有重要意義。MAPK信號(hào)通路在卵泡生長(zhǎng)、發(fā)育、成熟過程中有重要的調(diào)節(jié)作用[29]。Ras信號(hào)通路參與卵巢顆粒細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和增殖過程，間接影響卵母細(xì)胞的成熟，當(dāng)通路中任一環(huán)節(jié)發(fā)生異常時(shí)，可以導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生[30]。TP53信號(hào)通路也是卵巢早衰發(fā)生發(fā)展的重要通路之一，TP53的一個(gè)同系物TAp63是DNA損傷凋亡通路的關(guān)鍵調(diào)控因子，當(dāng)細(xì)胞DNA受損時(shí)，TAp63與磷酸化的非受體酪氨酸激酶c-Abl相互作用，激活下游信號(hào)分子促凋亡基因，誘發(fā)細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，直接或間接使卵巢儲(chǔ)備功能下降[31]。以上結(jié)果提示，菟絲子-枸杞子藥對(duì)可能通過調(diào)節(jié)上述代謝通路進(jìn)而改善卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育、顆粒細(xì)胞的增殖分化和卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)過程，發(fā)揮治療卵巢早衰的作用。

4 結(jié)語

本研究通過檢索共獲得菟絲子-枸杞子藥對(duì)的活性成分42個(gè)，活性成分治療卵巢早衰的潛在作用靶點(diǎn)有149個(gè)?；钚猿煞?靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)直觀體現(xiàn)了該藥對(duì)通過多成分、多靶點(diǎn)治療卵巢早衰的特點(diǎn);同時(shí)，靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)反映出該藥對(duì)治療卵巢早衰相關(guān)的各靶點(diǎn)之間聯(lián)系緊密;通過GO富集分析和KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，菟絲子-枸杞子藥對(duì)治療卵巢早衰涉及多種細(xì)胞生物過程和信號(hào)通路。以上均表明菟絲子-枸杞子藥對(duì)治療卵巢早衰的作用機(jī)制較為復(fù)雜，涉及多個(gè)活性成分、作用靶點(diǎn)及生物通路。本研究對(duì)藥物治療作用的潛在分子機(jī)制進(jìn)行了初步探討，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究奠定了基礎(chǔ)。但考慮到兩味中藥組合一起在煎煮時(shí)可能會(huì)發(fā)生復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)，本研究忽略了菟絲子-枸杞子藥對(duì)煎煮后的化學(xué)成分及藥材中各成分的含量，故具有一定的局限性，其具體作用機(jī)制還需后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究加以驗(yàn)證。同時(shí)，除現(xiàn)有相關(guān)研究報(bào)道的活性成分外，本研究還發(fā)現(xiàn)了菟絲子-枸杞子藥對(duì)治療卵巢早衰的其他潛在活性成分（芝麻素、豆甾醇等）以及靶點(diǎn)（IL6、TNF等），為卵巢疾病后續(xù)治療及新藥研發(fā)提供了參考。

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（收稿日期：2020-06-08 修回日期：2020-08-02

（編輯：鄒麗娟）