黃子圣 黃迪,3 黃宇,3 何志翔, 李佩霖 翁杰鋒,3 李桃生,3 古維立,,3

1 廣州醫(yī)科大學附屬廣州市第一人民醫(yī)院 肝膽外科(廣州 510180) 2 華南理工大學附屬第二醫(yī)院 肝膽外科(廣州 510180) 3 廣州消化疾病中心 (廣州 510180)

肝纖維化(hepatic fibrosis， HF)目前是世界上常見的疾病之一，是導致其他肝病如肝硬化和肝癌的主要原因。肝纖維化是一個動態(tài)的過程，其特征是任何病因的慢性肝損傷，包括病毒感染、酒精性肝病等引起細胞微環(huán)境變化[1-2]。長期以來，生物力學一直是肝病學研究和治療的重點。既往研究表明，門靜脈高壓癥，膽管梗阻等機械動力學變化，可能激活肝星狀細胞向肌成纖維細胞表型轉化，促進肝纖維化，其中門靜脈高壓被認為是決定患者功能狀態(tài)的關鍵因素[3]。細胞間質液壓力(interstitial fluid pressure，IFP)作為生物力的關鍵部分，對細胞的分化，生長和存活有著重要影響[4]。然而，細胞間質液壓力對肝星狀細胞激活和增殖的影響和以及是否影響肝細胞的表型變化目前仍然模糊不清[5-6]。我們擬通過模仿細胞間質液壓力的升高，對肝星狀細胞給予不同程度的機械性壓力性刺激，觀察壓力刺激對肝臟組織細胞特性的影響效果。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

人肝星狀細胞(HSC)購自Sciencell(#5300)；Triton X-100購自SIGMA(美國)，α-SMA抗體，ROCK抗體，RhoA抗體購自CST公司(美國)，藥物ROCK抑制劑Y-27632購自ATCC公司(美國)；共聚焦顯微鏡OLYMOUS，日本。Roche LightCycler 480# PCR 儀(美國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及分組

人肝星狀細胞隨機分為3組，每組3皿，其中模型組：將其置于壓力箱中施加恒定的高于大氣壓50 mmHg壓力；實驗組：加入ROCK抑制劑Y-27632(濃度10 μmol)置于與實驗組相同條件；對照組：不加壓置于相同培養(yǎng)箱中。模型組及實驗組分別加壓1 h和12 h后取細胞于光鏡觀察。

1.2.2 肝纖維化相關 PCR 檢測

實時熒光定量PCR法檢測各組HSC細胞中α-SMA、RhoA、ROCK mRNA的表達量：收集處理過12 h各組HSC細胞，加入Trizol裂解液，參照 Trizol 試劑 說明書提取各組細胞的總RNA。 以超微量蛋白核 酸定量檢測儀測定 RNA純度和濃度， 選取合格RNA樣品逆轉錄合成cDNA。以稀釋的 cDNA 為模板，使用實時熒光定量PCR檢測試劑盒進行檢測。α-SMA 的正向引物序列為5′GTGACGAAGCACAGAGCAAA 3′；反向引物序列為5′CTTTTCCATGTCGTCCCAGT 3′；RhoA的正向引物序列為5′CAGAAAAGGGACCCCAGAA 3′，反向引物序列為 5′GCAGCTGCTCTCGTAGCCATTTC 3′；ROCK1的正向引物序列為5′AACATGCTGCTGGATAAATCTGG 3′，反向引物序列為5′AGGAAGGCATGGTACGATGTGATACA 3′。GAPDH的正向引物序列為 5′GACTCATGACCACAGTCCATGC 3′；反向引物序列為 5′AGAGGCAGGGATGATGTTCTG 3′。反應條件為94 ℃預變性30 s，94 ℃變性5 min，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)。以 GAPDH為內參照，采用 2-ΔΔCT法計算各組HSC 細胞中α-SMA、RhoA、ROCK mRNA基因的相對表達水平。

1.2.3 免疫熒光染色檢測α-SMA、ROCK1、ROCK2蛋白表達

免疫熒光檢測α-SMA、ROCK1、ROCK2的表達：各組細胞按實驗條件處理12 h，然后應用4%多聚甲醛固定30 min，0.1%Triton-X100通透10 min，封閉液室溫下封閉1 h，一抗4 ℃過夜，熒光二抗室溫避光孵育2 h；DAPI染色10 min，滴加封片劑封片，熒光顯微鏡下拍照。實驗重復3次，見表1。

表1 間質液壓變化對各組肝星狀細胞α-SMA、ROCK1、ROCK2 熒光值比較

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結 果

2.1 間質液壓變化對人肝星狀細胞的形態(tài)影響

隨著間質液壓的增加，經過1 h或12 h 50 mmHg 壓力加壓后，HSC細胞的大小和形態(tài)在光鏡下并未出現明顯改變。說明50 mmHg壓力對細胞形態(tài)學變化影響不大，見圖1。

圖1 光鏡下間質液壓變化對肝星狀細胞的形態(tài)影響

2.2 間質液壓變化對人肝星狀細胞中α-SMA、RhoA、ROCK mRNA的表達量影響

通過 qRT-PCR 檢測各組肝星狀細胞α-SMA、RhoA、ROCK mRNA表達水平，可見在各組肝臟中均有表達(見圖2)。通過比較對照組與模型組細胞各種細胞因子的表達，在1 h壓力組中，α-SMA、RhoA mRNA的表達量均比對照組表達量增加，而 ROCK mRNA的表達量無明顯變化；12 h組中α-SMA、RhoA、ROCK mRNA的相對表達量分別為6.14±0.69、0.95±0.22、1.13±0.22，12 h組中α-SMA mRNA的表達量明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

圖2 間質液壓變化對各組肝星狀細胞α-SMA、RhoA、ROCK mRNA表達量比較ns P>0.05， **P<0.01(α-SMA 1h P=0.001 5，12h P=0.000 5；RhoA 1h P=0.000 1，12h P=0.065 6；ROCK 1h P=0.084 6,12h P=0.106 8)

2.3 免疫熒光染色檢測間質液壓變化對肝星狀細胞中α-SMA、ROCK1、ROCK2蛋白表達

在人肝星狀細胞中，α-SMA主要在細胞骨架上表達(見圖3)，ROCK1蛋白主要在人肝星狀細胞細胞質表達在細胞核內，ROCK2蛋白在人肝星狀細胞細胞質和細胞核中，免疫熒光表現為綠色。免疫熒光染色結果顯示：經壓力處理后的肝星狀細胞α-SMA、ROCK1蛋白水平增加，而ROCK2蛋白表達水平無明顯改變，提示間質液壓變化處理可引起肝星狀細胞表達更多的α-SMA及 ROCK1蛋白。經ROCK抑制劑Y-27632處理后，各組的蛋白表達均有下降，且能降低肝星狀細胞的α-SMA的表達。(見圖3)

肝星狀細胞的α-SMA蛋白在間質液壓變化處理后表達明顯，而在用ROCK抑制劑Y27632處理后，其表達明顯減少。ROCK1蛋白在人肝星狀細胞主要在細胞質表達，在細胞核內少許表達，在間質液壓變化處理后顯著表達，使用ROCK抑制劑Y27632處理后，與模型組相比其表達明顯減少，而與對照組差異不大。ROCK2蛋白在人肝星狀細胞細胞質和細胞核均有所表達(見圖3)，在對照組中ROCK2蛋白表達量較高， 其在經壓力處理后的星狀細胞表達與對照組相比無明顯差異，而在用ROCK抑制劑Y27632處理后，與模型組相比其表達明顯減少(P<0.01)，而與對照組差異不大。

圖3 間質液壓變化對各組肝星狀細胞α-SMA、ROCK1、ROCK2蛋白表達ns P>0.05， **P<0.01(α-SMA pre P=0.000 1，Y27 P=0.078 9；ROCK1 pre P=0.000 1，Y27 P=0.000 6；ROCK2 pre P=0.370 9，Y27 P=0.000 1)

3 討 論

細胞是受牛頓力學定律控制的動態(tài)物理結構，具有精確感知和施加機械力的能力。它們將機械信號與化學信號整合在一起，并根據各種外部機械信號改變行為[1]。肝纖維化是一個動態(tài)的過程，其特征是任何病因的慢性肝損傷，包括病毒感染、酒精性肝病和非酒精性脂肪性肝炎等引起細胞微環(huán)境改變而導致的。由于體內所有細胞液體微環(huán)境會受到一些常見的機械力的影響，不同類型的細胞的機械敏感性也會有所不同，對特定機械刺激的閾值不同。既往研究表明[2]，門靜脈高壓癥，膽管梗阻等機械動力學變化，可能激活肝星狀細胞向肌成纖維細胞表型轉化，促進肝纖維化，但細胞間質液壓對肝星狀細胞激活和增殖的影響和以及是否影響肝細胞的表型變化目前仍然模糊不清。細胞骨架從細胞外基質接收到的機械力信號不僅改變細胞本身的功能形態(tài)，而且還通過鈣黏著蛋白-細胞粘附復合物轉移到了相鄰的細胞。細胞通過改變其微環(huán)境的組成，組織的彈性，并響應于這種抗張性互相調節(jié)。因此，通過模仿細胞間質液壓的升高，我們試圖對肝星狀細胞給予不同程度的機械性壓力性刺激，觀察壓力刺激對肝臟組織細胞特性的影響。

轉化蛋白RhoA是Rho GTP酶家族中的一種小GTP酶蛋白。其功能主要與細胞骨架調節(jié)有關[5]。ROCK最初被認為是RhoA的下游效應子?？沈寗蛹毎湛s，并且是纖維化病理的介質。肌成纖維細胞的ROCK活性可通過纖維化期間增加肺基質的剛度，誘導HSC向肌成肌纖維表型的分化，增加α-SMA的表達，增強肌動蛋白細胞骨架的聚合活化[7]。在纖維化過程中，ROCK介導的作用是機械敏感性的[8]。這與我們研究結果相符，當肝星狀細胞暴露在高間質液壓環(huán)境下，α-SMA的表達升高，且與ROCK1的表達相聯(lián)系。

在組織纖維化前期，組織內部往往有強烈的炎癥反應，微環(huán)境中的溫度，氧氣利用率，細胞因子和滲透壓等會出現大幅度波動從而引起間質液壓力的變化。這與我們研究發(fā)現間質液壓力早期對肝星狀細胞的影響相符，RhoA mRNA在肝星狀細胞中只有在加壓早期的表達上升，在壓力后期表達與對照組無差異。我們研究發(fā)現，升高的細胞間質液壓通過ROCK1而非ROCK2引發(fā)肝星狀細胞的活化。在一般環(huán)境下，肝星狀細胞中的ROCK1和ROCK2蛋白的表達已有著明顯差異，ROCK1的表達量少而ROCK2的表達量高。在間質液壓升高情況下，肝星狀細胞中的α-SMA大量表達，提示肝星狀細胞激活，證實了機械壓力對肝纖維化的促進作用。與此同時我們發(fā)現，肝星狀細胞中ROCK1的表達有著明顯提高，而ROCK2表達量則幾乎不變，這提示機械壓力對肝星狀細胞的刺激主要影響ROCK1，這為我們使用ROCK制劑治療肝纖維化提供了依據。使用ROCK抑制劑Y27632后ROCK1和ROCK2的表達明顯較少，同時α-SMA的表達也明顯減少，證明了ROCK抑制劑對肝纖維化的發(fā)展的抑制效果。我們的研究表明細胞間質液壓升高能通過RhoA/ROCK1信號通路引起肝星狀細胞的活化，研究RhoA/ROCK1信號通路可能為將來開發(fā)一種新的臨床治療肝纖維化的方法提供實驗基礎。