黃澄，陳睿，朱春燕，盧良華，王成華

(廣西大學(xué) 輕工與食品工程學(xué)院，廣西 南寧，530000)

菊粉是由D-呋喃果糖通過(guò)β-2,1-糖苷鍵縮合形成的線性鏈狀多糖，且末端以α-1，2-糖苷鍵連接一個(gè)葡萄糖殘基，通常包含2～60個(gè)果糖單元[1-2]。作為一種常見(jiàn)的植物貯藏性多糖，菊粉存在于全世界超過(guò)36 000種植物組織中[3]。其中，菊芋塊莖含有大量的菊粉，約占其塊莖干重的70%[4]，其種植簡(jiǎn)單、適應(yīng)性強(qiáng)[5]，成為目前生產(chǎn)菊粉的最常用植物。菊粉作為可再生非糧生物質(zhì)資源，在生產(chǎn)高果糖漿、生物乙醇、低聚果糖等食品、生物化工領(lǐng)域具有廣闊的市場(chǎng)[6]。

菊粉酶，學(xué)名β-2,1-D-果聚糖酶，一種能夠水解β-2,1-D-果聚糖糖苷鍵的水解酶，是開(kāi)發(fā)利用菊粉等果糖基可再生資源的關(guān)鍵酶類(lèi)。根據(jù)菊粉酶作用方式的不同，可將菊粉酶分為2類(lèi)，外切型菊粉酶和內(nèi)切型菊粉酶。內(nèi)切菊粉酶可隨機(jī)水解菊粉鏈內(nèi)部的糖苷鍵，生成物主要為低聚果糖；外切菊粉酶則逐一水解菊粉鏈的非還原性末端的糖苷鍵，主要產(chǎn)物為果糖和少量葡萄糖，可被用于菊粉高果糖漿的生產(chǎn)等[7-8]。目前報(bào)道的大多數(shù)菊粉酶最適pH范圍在4.5～6.5[9-10]，而酸性條件(pH<4.5)更利于維持果糖的穩(wěn)定性、抑制微生物污染以及有效抑制副產(chǎn)物和色素的產(chǎn)生。因此，大力開(kāi)發(fā)高效酸性菊粉酶，對(duì)于改進(jìn)已有酶法工藝、提高生產(chǎn)效率等具有重要的應(yīng)用前景和商業(yè)潛力。國(guó)內(nèi)外已開(kāi)展了馬克斯克魯維酵母等來(lái)源菌株菊粉酶的篩選，同時(shí)開(kāi)展了畢赤酵母等基因工程菌生產(chǎn)重組菊粉酶的研究，但鮮見(jiàn)報(bào)道來(lái)源于食品級(jí)微生物的酸性菊粉酶。PALUDAN-MüLLER等[11]報(bào)道了1株產(chǎn)弱酸性菊粉酶的Lactobacilluspentosus，這也是目前報(bào)道的唯一一個(gè)乳酸菌來(lái)源的食源酸性菊粉酶，這為篩選新型酸性乳酸菌菊粉酶提供了思路。本研究從課題組前期構(gòu)建的來(lái)源于廣西特色生榨米粉的乳酸菌庫(kù)中篩選出產(chǎn)酸性菊粉酶的乳酸菌，對(duì)其分類(lèi)鑒定，并進(jìn)行及酶學(xué)性質(zhì)的研究和水解產(chǎn)物的檢測(cè)，為酸性菊粉酶的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供了新的選擇。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

廣西特色生榨米粉來(lái)源乳酸菌，本實(shí)驗(yàn)室保藏；菊粉(90%)，上海源葉生物公司；酵母提取物,OXOID 公司；蛋白胨、牛肉膏，Solarbio公司；K2HPO4、MgSO4、MnSO4、醋酸鈉、檸檬酸二銨、吐溫-80、3,5-二硝基水楊酸，成都金山化學(xué)試劑有限公司；(NH4)2SO4、NaOH、醋酸、正丁醇、磷酸、異丙醇、二苯胺、丙酮、苯胺、結(jié)晶酚，成都市科龍化工試劑廠；微量點(diǎn)樣毛細(xì)管、硅膠層析板(20 cm×20 cm)，青島海洋化工廠；菊糖、果糖、蔗糖、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，Sigma公司；瓊脂糖，OMEGA 公司;細(xì)菌基因組DNA試劑盒、DNA純化試劑盒，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

DNS試劑：稱(chēng)取5.3 g 3,5-二硝基水楊酸、9.9 g NaOH于708 mL水中，充分溶解后加入153 g酒石酸鉀鈉，再加入4.15 g Na2SO3和 3.8 mL 45 ℃水浴溶解的結(jié)晶酚，不斷攪拌直至完全溶解后，定容至1 000 mL，貯存于棕色瓶中，于室溫避光放置7 d。

培養(yǎng)基：20 g菊粉、10 g牛肉粉、5 g酵母提取物、10 g蛋白胨、2.0 g檸檬酸二銨、5.0 g乙酸鈉、2 g K2HPO4、0.58 g MgSO4、0.25 g MnSO4、1 mL吐溫-80，1 000 mL蒸餾水，pH 6.6～6.8，配制固體培養(yǎng)基時(shí)，加入瓊脂20 g，121 ℃高壓滅菌 15 min。

薄層層析(thin-layer chromatography，TLC)試劑：展開(kāi)劑為正丁醇、異丙醇、醋酸、水按7∶5∶1∶2(體積比)混合，顯色劑為體積分?jǐn)?shù)2%二苯胺-丙酮溶液、體積分?jǐn)?shù)2%苯胺-丙酮溶液、體積分?jǐn)?shù)85%磷酸按5∶5∶1(體積比)混合。

1.2 儀器設(shè)備

SW-SJ-2F超凈工作臺(tái)，蘇凈安泰公司；5401D006843 低溫高速離心機(jī)，Eppendorf公司；TOMY Autoclave 高壓滅菌鍋，TOMY公司；DYY-8C 電泳儀，北京六一生物科技有限公司；MJ-Ⅱ 電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；Infinite M200 PRO 酶標(biāo)儀，TECAN公司；ChemiDoc MP 全能型凝膠成像分析儀、T100 梯度PCR儀，Bio-Rad公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 產(chǎn)菊粉酶菌株篩選

初篩：將本課題組前期從廣西壯族傳統(tǒng)生榨米粉中篩選出的乳酸菌劃線至固體培養(yǎng)基中(菊粉為唯一碳源)，于30 ℃靜置培養(yǎng)直至出現(xiàn)單菌落，將正常生長(zhǎng)的單菌落接種至液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30 ℃靜置發(fā)酵1～2 d。

復(fù)篩：取出15 mL初篩所制備的發(fā)酵液在4 ℃條件下，10 000 r/min離心2 min，棄上清液，用600 μL醋酸緩沖溶液(0.2 mol/L、pH 5.0)重懸沉淀，后加入溶菌酶進(jìn)行破胞，破胞結(jié)束后，按上述相同條件離心40 min，檢測(cè)上清液中的菊粉酶酶活力，選出其中酶活力最高的菌株 1-1進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.2 酶活力測(cè)定

酶活力測(cè)定中所用底物質(zhì)量濃度均為5 g/L，菊粉溶液和蔗糖溶液均用醋酸緩沖液(0.2 mol/L、pH 5.0)配制而成。

參照PESSONI等[12]的方法對(duì)菊粉酶進(jìn)行酶活力測(cè)定。取100 μL酸性菊粉酶分別加入200 μL 5 g/L菊粉溶液和200 μL 5 g/L蔗糖溶液，在30 ℃水浴中放置30 min后立即100 ℃滅活5 min，冷卻后加入300 μL DNS，置于100 ℃水浴中7 min進(jìn)行顯色，迅速冷卻后在540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值，參照葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)計(jì)算還原糖含量，以滅活的酶液作為空白對(duì)照。設(shè)3次重復(fù)試驗(yàn)，取平均值。

酶活力定義[13]：在30 ℃、pH 5.0的條件下，每1 min產(chǎn)生1 μmol還原糖所需的酶量，即為1個(gè)酶活力單位(U)。其中1個(gè)菊粉酶活力(I)單位定義為每1 min催化菊粉轉(zhuǎn)化為1 μmol果糖所需的酶量，1個(gè)轉(zhuǎn)化酶活力(S)單位定義為每1 min催化蔗糖轉(zhuǎn)化為1 μmol果糖所需的酶量。

(1)

式中：E，樣品酶活力，U/mL；c，標(biāo)準(zhǔn)曲線上對(duì)應(yīng)的葡萄糖濃度，μmol/mL；V1，反應(yīng)液總體積，mL；n，粗酶液稀釋倍數(shù)；T，反應(yīng)時(shí)間，min；V2，反應(yīng)液中粗酶體積，mL。

1.3.3 菌株鑒定

通過(guò)菌落觀察和基因序列分析對(duì)菌株進(jìn)行鑒定。使用細(xì)菌基因組DNA試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)提取菌株基因組DNA，使用超微量全波長(zhǎng)分光光度計(jì)對(duì)提取的基因DNA樣液進(jìn)行定量，將其稀釋至1 ng/μL，并以此作為PCR擴(kuò)增的模板。使用細(xì)菌通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1429R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，進(jìn)行30次循環(huán)，72 ℃終延伸2 min。取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，將驗(yàn)證后的PCR產(chǎn)物通過(guò)DNA純化試劑盒進(jìn)行純化，再由六合華大基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果輸入基因數(shù)據(jù)庫(kù)(GenBank)進(jìn)行同源性分析。

1.3.4 酶學(xué)性質(zhì)研究

1.3.4.1 溫度對(duì)粗酶液酶活力和穩(wěn)定性的影響

參照1.3.2的酶活力測(cè)定，將菊粉酶分別在20～80 ℃進(jìn)行反應(yīng)，每5 ℃為1個(gè)溫度梯度，測(cè)定酶活力，以測(cè)定結(jié)果最高酶活力為100%，計(jì)算各測(cè)定組的相對(duì)酶活力；將菊粉酶分別在20～80 ℃保溫30 min，冷卻后測(cè)定酶活力，以未經(jīng)處理酶的酶活力為100%，計(jì)算各組的相對(duì)酶活力。

1.3.4.2 pH對(duì)粗酶液活力和穩(wěn)定性的影響

參照1.3.2的酶活力測(cè)定，配制不同pH的緩沖液，pH 3.5～5.0為醋酸緩沖液，pH 5.5～7.5為磷酸緩沖液，pH 8.0～9為T(mén)ris-HCl緩沖液，pH 9.5～11.0為碳酸緩沖液。將菊粉酶與上述不同pH緩沖液配制的菊粉溶液進(jìn)行反應(yīng)，測(cè)定酶活力，以最高結(jié)果為100%，計(jì)算各測(cè)定組的相對(duì)酶活力；用不同pH的緩沖液稀釋菊粉酶液，于4 ℃放置1 h，測(cè)定酶活力，以未經(jīng)處理酶的酶活力為100%，計(jì)算各組的相對(duì)酶活力。

1.3.5 TLC分析水解產(chǎn)物

以菊粉為底物，將200 μL菊粉酶與100 μL底物在最適溫度、最適pH條件下水解10 h，得到水解產(chǎn)物。TLC方法參照文獻(xiàn)報(bào)道[14]。用去離子水將各標(biāo)準(zhǔn)品配制成質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品試劑，用微量點(diǎn)樣毛細(xì)管依次對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品試劑和水解產(chǎn)物進(jìn)行點(diǎn)樣，點(diǎn)樣量5 μL。展開(kāi)完成后噴霧顯色劑，待自然風(fēng)干后置于105 ℃加熱5 min，即可進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)菊粉酶菌株篩選

在本課題組的廣西特色生榨米粉來(lái)源乳酸菌庫(kù)中，篩選出1株可以正常生長(zhǎng)在以菊粉為唯一碳源的培養(yǎng)基上，且具有相對(duì)較高酶活力的菌株1-1，后續(xù)試驗(yàn)均選用此菌株。以菊粉為底物，在30 ℃，pH 5.0條件下進(jìn)行3組平行試驗(yàn)，取平均值，測(cè)得菌株1-1的菊粉酶活力I=(0.23±0.03) U/mL；以蔗糖為底物，在30 ℃，pH 5.0條件下進(jìn)行3組平行試驗(yàn)，取平均值，測(cè)得菌株1-1的轉(zhuǎn)化酶活力S=(0.92±0.06) U/mL，兩者的比值(I/S)為0.25，I/S<1表明該酶為外切菊粉酶[15]，其菊粉酶活力略低于王翠[7]報(bào)道放線菌F01的菊粉酶活力(0.37 U/mL)。

2.2 菌株鑒定

菌株1-1菌落形態(tài)如圖1所示，圓形隆起，表面光滑或稍粗糙，呈乳白色或暗黃色。以基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增16S rDNA序列。PCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果如圖2所示，擴(kuò)增條帶在1 500 bp左右，與預(yù)期相符。

M-marker; 1-菌株圖1 菌株1-1平板培養(yǎng)菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of 1-1

M-marker;1-菌株圖2 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR

16S rDNA基因序列與GenBank中進(jìn)行序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其與檸檬明串珠菌Leuconostoccitreumstrain CBA3623相似率達(dá)99.59%，可初步鑒定該菌株為檸檬明串珠菌Leuconostoccitreum，將其命名為L(zhǎng)euconostoccitreum1-1，并將該菌株保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC NO：M 2019971。

2.3 酶學(xué)性質(zhì)研究

2.3.1 溫度對(duì)菊粉酶酶活力和穩(wěn)定性的影響

以菊粉為底物，對(duì)菌株1-1所產(chǎn)菊粉酶的最適反應(yīng)溫度和溫度穩(wěn)定性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖3所示。

a-溫度對(duì)酶活力的影響; b-溫度對(duì)穩(wěn)定性的影響圖3 溫度對(duì)酶活力和穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effect of temperature on activity and stability of the inulinase

由圖3-a可知，該酶的最適反應(yīng)溫度為35 ℃，比PALUDAN-MULLER人[11]報(bào)道的Lactobacilluspentosus所產(chǎn)菊粉酶最適溫度高10 ℃。由圖3-b可知，該酶在熱處理30 min條件下，20～45 ℃保持60%以上的最大酶活力。以上結(jié)果表明篩選的菊粉酶具有相對(duì)較高的最適反應(yīng)溫度和較寬的溫度耐受范圍，在工業(yè)生產(chǎn)中具有一定的開(kāi)發(fā)潛力。

2.3.2 pH對(duì)菊粉酶活力和穩(wěn)定性的影響

菌株1-1菊粉酶的最適反應(yīng)pH和pH穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果如圖4所示。由圖4-a可知，該酶的最適反應(yīng)pH為4.0，低于目前已報(bào)道的菊粉酶，如于春等[16]報(bào)道的灰平鏈霉菌StreptomycesgriseoplanusS501的最適pH(5.0)和高威[17]報(bào)道的BacillussmithiiT4的最適pH(4.5)。如圖4-b所示，該酶在pH 3.5～10.0較寬泛范圍內(nèi)，保持65%以上的酶活力。該酸性菊粉酶有著較強(qiáng)的耐酸特性和較寬的pH耐受范圍，有利于菊粉的水解以及抑制副產(chǎn)物的產(chǎn)生。

a-pH對(duì)酶活力的影響; b-pH對(duì)穩(wěn)定性的影響圖4 pH對(duì)酶活力和穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of pH on activity and stability of the inulinase

2.3.3 TLC分析水解產(chǎn)物

采用TLC對(duì)L.citreum1-1菊粉酶水解菊粉的產(chǎn)物進(jìn)行分析，結(jié)果如圖5所示。

1-菊糖；2-果糖；3-葡萄糖；4-蔗糖；5-水解產(chǎn)物圖5 菊粉酶水解產(chǎn)物TLC分析Fig.5 TLC for characterization of inulin hydrolysis products by inulinase

從圖5可知，在菊粉酶與菊粉反應(yīng)后，菊粉得到了明顯的降解，降解產(chǎn)物中幾乎100%為單糖，產(chǎn)生大量果糖以及少量葡萄糖，無(wú)蔗糖成分，這與L.citreum1-1菊粉酶為外切菊粉酶從非還原末端逐一降解糖苷鍵生成果糖和少量葡萄糖的作用方式相一致，同時(shí)與根據(jù)I/S值的鑒定結(jié)果一致。因此，L.citreum1-1菊粉酶具有應(yīng)用于高果糖漿生產(chǎn)的潛力。

3 結(jié)論

研究首次從廣西壯族傳統(tǒng)生榨米粉中篩選出1株產(chǎn)酸性外切菊粉酶的檸檬明串珠菌L.citreum1-1。該菌株所產(chǎn)菊粉酶的酶活力為0.23 U/mL，轉(zhuǎn)化酶活為0.92 U/mL，最適反應(yīng)溫度為35 ℃，最適反應(yīng)pH為4.0，在20～45 ℃和pH 3.5～10.0的較寬范圍內(nèi)保持穩(wěn)定，水解產(chǎn)物為大量果糖和少量葡萄糖。

研究目前對(duì)L.citreum1-1只進(jìn)行了初步研究，未對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，可能是其酶活力較低的原因，但是該酶具有更低的最適反應(yīng)pH和較強(qiáng)的耐酸性，更有利于大規(guī)模生產(chǎn)，且該酶來(lái)源于傳統(tǒng)食品來(lái)源的檸檬明串珠菌，作為一種食源性乳酸菌酸性菊粉酶，其安全性在食品行業(yè)具有廣闊的發(fā)展前景和商業(yè)價(jià)值。今后的研究將致力于菌株產(chǎn)酶發(fā)酵條件的優(yōu)化，以及基因重組的手段實(shí)現(xiàn)菊粉酶的高效表達(dá)和酶學(xué)性質(zhì)表征，為工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)菊粉酶制劑以及高果糖漿的開(kāi)發(fā)利用打下基礎(chǔ)。