路 琳，顧藝荀，徐興祥，閔凌峰，陳彥亮，王霄霖，陳 勇*

(蘇北人民醫(yī)院 1.腫瘤科；3.呼吸與重癥內(nèi)科； 4.胸外科， 江蘇 揚(yáng)州 225001;2.大連醫(yī)科大學(xué)， 遼寧 大連 116044)

肺癌是全世界范圍內(nèi)發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤[1]，肺癌組織學(xué)類(lèi)型中肺鱗癌約占全部肺癌的30%。由于肺鱗癌的基因型更復(fù)雜、EGFR突變率低[2-3]，靶向治療并沒(méi)有為肺鱗癌患者帶來(lái)治療療效上的突破[4]。WNT信號(hào)傳導(dǎo)途徑是由配體蛋白WNT和膜蛋白受體結(jié)合激發(fā)的一組多下游通道的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖分化、侵襲和凋亡起著重要作用。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種WNT蛋白，本研究通過(guò)檢測(cè)肺鱗癌患者腫瘤組織標(biāo)本中WNT10B的表達(dá)狀況，分析WNT10B與臨床病理特征之間的關(guān)系，分析WNT10B的表達(dá)與肺鱗癌患者預(yù)后的聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來(lái)源：肺鱗癌標(biāo)本組織芯片(HLug-Squ150Sur-01)(上海芯超生物科技有限公司肺癌組織芯片庫(kù))，包含75例肺鱗癌組織及與之配對(duì)的癌旁正常肺組織，組織芯片的每個(gè)點(diǎn)都經(jīng)過(guò)病理診斷，手術(shù)時(shí)間為2004年7月至2007年11月，隨訪(fǎng)截至2012-07-31。所有患者術(shù)前均未接受放化療或其他抗腫瘤治療，所有臨床病理資料及隨訪(fǎng)數(shù)據(jù)均來(lái)自上海芯超生物科技有限公司?；颊咧心?0例，女5例。年齡36～78歲，中位年齡64歲，其中<70歲48例，≥70歲26例，無(wú)法判斷1例。T1期17例，T2期39例，T3期12例，T4期6例，無(wú)法判斷1例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例，無(wú)轉(zhuǎn)移40例，無(wú)法判斷5例。無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移73例，有轉(zhuǎn)移2例。組織學(xué)分級(jí)為Ⅰ級(jí)13例，Ⅱ級(jí)40例，Ⅲ級(jí)22例。根據(jù)UICC第7版TNM 分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期27例，Ⅱ～Ⅳ期46例，無(wú)法分期2例。

1.1.2 試劑：小鼠抗人WNT10B 單克隆抗體(5A7)(Abcam公司)，羊抗鼠HRP二抗及二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2 免疫組化染色檢測(cè)蛋白表達(dá)

采用二步法進(jìn)行免疫組化染色，嚴(yán)格按照試劑操作說(shuō)明進(jìn)行，組織芯片先經(jīng)脫蠟水化，經(jīng)乙二胺四乙酸(EDTA)抗原修復(fù)液修復(fù)，一抗孵育(WNT10B鼠抗人單克隆抗體，1∶5 000稀釋)，4 ℃過(guò)夜，加羊抗鼠HRP二抗，37 ℃孵育1 h， DAB顯色，蘇木精復(fù)染，梯度乙醇脫水后封片。WNT10B蛋白陽(yáng)性染色為細(xì)胞質(zhì)呈黃色至棕黃色。在雙盲情況下，由兩名病理科醫(yī)師對(duì)每個(gè)標(biāo)本進(jìn)行染色結(jié)果判斷及評(píng)分：細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)淡黃色至棕褐色顆粒狀物視為陽(yáng)性，未出現(xiàn)視為陰性。陽(yáng)性染色強(qiáng)度計(jì)分：無(wú)陽(yáng)性染色，弱陽(yáng)性(+)；黃褐色，陽(yáng)性(++)；深棕褐色，強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。陰性及弱陽(yáng)性表達(dá)納入低表達(dá)組；陽(yáng)性及強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)納入高表達(dá)組。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)。Kaplan-Meier 生存分析和log-rank檢驗(yàn)以及Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析WNT10B蛋白表達(dá)與肺鱗癌預(yù)后的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 WNT10B在肺鱗癌組織中的表達(dá)

整個(gè)組織芯片有5例癌組織脫片無(wú)法評(píng)價(jià)，癌旁有1例組織脫片無(wú)法評(píng)價(jià)，WNT10B主要表達(dá)于肺鱗癌細(xì)胞質(zhì)中，WNT10B在癌旁正常肺組織中低表達(dá)(圖1，2)。WNT10B在肺鱗癌組織的表達(dá)明顯高于癌旁正常肺組織(P<0.05)(表1)。

表1 肺鱗癌與癌旁組織中WNT10B蛋白的表達(dá)Table 1 Expression of WNT10B protein in lung squamous cell carcinoma and adjacent tissues

圖1 肺鱗癌組織芯片的HE及WNT10B免疫組化染色結(jié)果Fig 1 HE staining and WNT10B immunohistochemical staining of lung squamous cell carcinoma tissue chips

from top to bottom were 0，+，++，+++圖2 肺鱗癌及癌旁正常組織中WNT10B的表達(dá)Fig 2 Expression of WNT10B in adjacent normal tissues and lung squamous cell carcinoma (×200)

2.2 WNT10B表達(dá)與肺鱗癌患者臨床病理特征關(guān)系

T3～T4期腫瘤的WNT10B表達(dá)顯著高于T1～T2期腫瘤 (P<0.05)；WNT10B的表達(dá)與腫瘤組織的分化程度顯著相關(guān)，分化越差，WNT10B表達(dá)越高 (P<0.05)(表2)。

表2 WNT10B表達(dá)與肺鱗癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系Table 2 Relationship between WNT10B expression and clinicopathological characteristics of patients with lung squamous cell carcinoma

2.3 WNT10B表達(dá)與肺鱗癌患者預(yù)后之間的關(guān)系

癌組織中WNT10B低表達(dá)者預(yù)后顯著優(yōu)于WNT10B 高表達(dá)者(P<0.05)(圖3)。性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和WNT10B的表達(dá)是肺鱗癌的獨(dú)立預(yù)后影響因素(表3)。

圖3 不同表達(dá)WNT10B水平肺鱗癌患者的生存曲線(xiàn)Table 3 Survival curves of patients with lung squamous cell carcinoma with different expression of WNT10B

表3 Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析結(jié)肺鱗癌預(yù)后相關(guān)因素Table 3 Cox proportional hazard model analyzes prognostic factors of lung squamous cell carcinoma

3 討論

WNT/β-catenin信號(hào)通路在生物體的發(fā)育中起重要作用[5]，而異常激活與腫瘤的發(fā)生發(fā)展緊密相關(guān)[6]。WNT家族至少包括19種WNT蛋白，其中WNT10B在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[7-11]。在胃癌中，抑制細(xì)胞WNT10B的表達(dá)導(dǎo)致了胃癌細(xì)胞的增殖侵襲能力下降[7]。在胰腺癌中，降低細(xì)胞WNT10B的表達(dá)能夠抑制胰腺癌細(xì)胞BxPC-3的侵襲和轉(zhuǎn)移[8]。在結(jié)直腸癌組織中WNT10B低表達(dá)，WNT10B低表達(dá)患者的預(yù)后優(yōu)于WNT10B高表達(dá)患者[11]。在子宮內(nèi)膜癌中，癌組織WNT10B的表達(dá)較正常組織高，但是隨著組織學(xué)分化越來(lái)越差，WNT10B的陽(yáng)性表達(dá)率逐漸降低，并且WNT10B高表達(dá)組患者的預(yù)后好于低表達(dá)組[12]。本研究運(yùn)用肺鱗癌組織芯片分析 WNT10B在肺鱗癌組織和癌旁組織的表達(dá)情況，結(jié)果表明WNT10B在肺鱗癌組織中高表達(dá)，而在癌旁組織中低表達(dá)，這一結(jié)果與既往研究結(jié)果一致[7-8]。通過(guò)臨床資料分析發(fā)現(xiàn)，WNT10B高表達(dá)者T分期越晚，分化程度越差。既往研究顯示W(wǎng)NT10B還參與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[7, 11]，但本研究未發(fā)現(xiàn)WNT10B的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，可能與病例數(shù)少以及部分?jǐn)?shù)據(jù)缺失有關(guān)。通過(guò)隨訪(fǎng)觀察，發(fā)現(xiàn)WNT10B表達(dá)和性別均是獨(dú)立的預(yù)后影響因素，但由于本組患者中僅有5例女性患者，所有本研究有關(guān)性別的結(jié)果還需要大樣本數(shù)據(jù)的進(jìn)一步的驗(yàn)證。本研究缺少肺部非腫瘤疾病的標(biāo)本，同時(shí)未進(jìn)行半定量分析，這些將會(huì)繼續(xù)予以改進(jìn)。

綜上所述， WNT10B在肺鱗癌組織中表達(dá)增高，并與臨床病理因素及預(yù)后密切相關(guān)，WNT10B有望成為肺鱗癌的一個(gè)新的腫瘤標(biāo)志物和預(yù)后指標(biāo)。同時(shí)，WNT10B在肺鱗癌中發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。