肖云峰盛惟劉劍（.內蒙古醫(yī)科大學新藥安全評價研究中心呼和浩特000；2.內蒙古盛唐國際蒙醫(yī)藥研究院有限公司 呼和浩特 00000；3.包頭朝聚眼科醫(yī)院 包頭 04060）

包頭朝聚眼科醫(yī)院在內蒙古自治區(qū)包頭市開展了為期80余天的青少年眼健康篩查工作。經過調研發(fā)現小學生近視發(fā)病率達24.76%，初中生近視發(fā)病率達50.7%，高中生近視發(fā)病率達55.87%[1]。

當今世界青少年越來越不注重用眼衛(wèi)生，加之日常生活中的電腦、手機使青少年用眼負荷過早增大，導致近視眼成為發(fā)病率最高的眼病之一[2-5]。如何預防和治療青少年近視成為醫(yī)學界關注的焦點[6，7]。1%硫酸阿托品擴瞳作用強，擴瞳后恢復較慢，一般患者不愿長時間使用。0.01%硫酸阿托品滴眼液阿托品含量適中，對睫狀肌麻痹作用弱，視近物不模糊，且對瞳孔無散大，對青少年近視有一定的恢復作用[8-10]。本研究為促進臨床安全使用0.01%硫酸阿托品滴眼液提供一定的理論依據。

1 實驗材料

1.1 實驗動物：Wistar大鼠，體質量180～220 g，清潔級，由內蒙古醫(yī)科大學實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證編號：SCXK（蒙）2015-0001。新西蘭大耳白兔，體質量1.7～2.1 kg，普通級，由內蒙古醫(yī)科大學實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證編號：SCXK（蒙）2015-0001。

1.2 受試藥物及主要試劑：0.01%硫酸阿托品滴眼液（包頭朝聚眼科醫(yī)院，批號20190909）；0.05%硫酸阿托品注射液（天津藥業(yè)集團新鄭股份有限公司，批號201904081）；0.9%氯化鈉注射液（貴州科倫藥業(yè)有限公司，批號E118052804）；無水乙醚（天津市富宇精細化工有限公司，批號20190627）；大鼠丙二醛（MDA）ELISA檢測試劑盒（泉州市睿信生物科技有限公司，批號20190901003）；大鼠總超氧化物歧化酶（T-SOD）ELISA檢測試劑盒（泉州市睿信生物科技有限公司，批號20190901008）；大鼠谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）ELISA檢測試劑盒（泉州市睿信生物科技有限公司，批號20191009005）；大鼠過氧化氫酶（CAT）ELISA檢測試劑盒（泉州市睿信生物科技有限公司，批號20191008008）；熒光素鈉（上海源葉生物科技有限公司，批號L03A10H94500）；硫化鈉（NaS）（天津永晟精細化工有限公司，批號 20180530）。

1.3 實驗儀器：電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司，型號BS2202S）；低溫冷凍離心機（美國SIGMA公司，型號3K15）；電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司，型號CICI-PI-150FEL）；實體解剖顯微鏡（德國Leica公司，型號DFC 290）；全自動酶標儀（美國 Thermo Fisher公司，型號 Multiskan MK3）；schiotz眼壓計（蘇州六六視覺科技股份有限公司，型號YZ7A）；裂隙燈顯微鏡（蘇州六六視覺科技股份有限公司，型號YZ5G）；微量移液器（美國Thermo Fisher公司，型號F2）；攝像機（日本索尼公司，型號HDR-PJ820E）。

2 實驗方法

2.1 視網膜光線異常敏感試驗

2.1.1 實驗動物及分組：選取健康Wistar大鼠60只，雌雄各半。適應性飼養(yǎng)7 d后，按性別、體重將大鼠隨機分為空白對照組（0.9%氯化鈉注射劑）、供試品組（0.01%硫酸阿托品滴眼劑）和對照高劑量組（0.05%硫酸阿托品注射劑），共3組，每組20只，雌雄各半。

2.1.2 強光損傷視網膜模型的建立：強光損傷視網膜的模型采用手術聯合光照箱法建立。在光照箱的六個面分別安裝4根15W的白色LED燈管（Philips），光照箱上方安裝通風孔，光照箱下方為密集的通風孔，光照箱內安放兩個體積為48 cm×24 cm×25 cm有機玻璃透明箱。大鼠正?；顒訒r，大鼠眼球水平的各箱壁照度均大于2740 lux，光照箱內的平均溫度控制在18℃～24℃，換氣次數≥15次/h。模型建立前的所有大鼠在每天12 h明（20～50 lux）以及12 h暗（0～12 lux）的循環(huán)光環(huán)境下適應10 d。第11天，將大鼠逐只放入玻璃乙醚麻醉缸中麻醉，麻醉后的大鼠使用角針和4#不可吸收縫合線在其眼瞼中部與鼻側皮膚處縫一針，使其無法閉眼。待大鼠清醒后逐只將其放入光照箱，持續(xù)接受照度大于2740 lux的光照射3 h。3 h光照后拆除眼瞼縫合線，將大鼠送回正常環(huán)境中。

2.1.3 給藥及取材：模型建立后對3組大鼠進行給藥?？瞻讓φ战M大鼠每眼給予0.9%氯化鈉注射劑0.05 mL，供試品組大鼠每眼給予0.01%硫酸阿托品滴眼劑0.05 mL，對照高劑量組大鼠每眼給予0.05%硫酸阿托品注射劑0.04 mL，開合眼瞼使受試物與大鼠眼球充分接觸。給藥24 h后，將大鼠進行乙醚麻醉，股動脈放血處死。迅速小心摘取大鼠雙側眼球，于實體解剖顯微鏡下，用眼科鑷夾住視神經側，使用鋒利的刀片劃開角膜，沿鋸齒緣剪掉角膜。將眼球放入生理鹽水，小心剝離視網膜與眼球后壁，摘下視網膜，用濾紙吸去視網膜表面液體。將雙側視網膜，放入1 mL生理鹽水，充分研磨制成勻漿，-4℃3 500 r/min離心10 min，取上清液，冷凍分裝。按照ELISA檢測試劑盒操作說明，測定視網膜中MDA、T-SOD、GSH-PX 和CAT含量。

2.2 眼壓檢測試驗

2.2.1 實驗動物及分組：選取健康新西蘭大耳白兔9只，雄性。家兔適應性飼養(yǎng)7 d后，按體重將兔隨機分為空白對照組（0.9%氯化鈉注射劑）、供試品組（0.01%硫酸阿托品滴眼劑）和對照高劑量組（0.05%硫酸阿托品注射劑），共3組，每組3只。

2.2.2 給藥及數據采集：試驗采用同體左右側自身對比法，空白對照組家兔左眼給予0.9%氯化鈉注射劑0.1 mL，供試品組家兔左眼給予0.01%硫酸阿托品滴眼劑0.1 mL，對照高劑量組家兔左眼給予0.05%硫酸阿托品注射劑0.08 mL，家兔右眼均不做處理。受試物滴入后，開合眼瞼使其與家兔眼球充分接觸，保證藥物充分暴露。在給藥后 1、2、4、24、48 和 72 h，使用 schiotz眼壓計測定家兔雙側眼壓并記錄。

2.3 急性眼刺激性試驗

2.3.1 實驗動物及分組：選取健康新西蘭大耳白家兔15只，雄性，適應性飼養(yǎng)7 d，適應性期間對動物進行體重測定和臨床癥狀觀察。給藥前24 h用帶磨鈍的8號注射針頭的注射器在兔兩側眼下穹窿部結膜處滴入2滴無菌的2%熒光素鈉溶液，1～2 min后觀察，黃綠色的染色可顯示角膜上皮缺損的部位及范圍，同時，使用裂隙燈對家兔雙眼結膜損傷情況進行檢查，剔除眼睛刺激癥狀、角膜缺陷和結膜損傷的兔后，留取9只。按體重將這9只兔隨機分為空白對照組（0.9%氯化鈉注射劑）、供試品組（0.01%硫酸阿托品滴眼劑）和對照高劑量組（0.05%硫酸阿托品注射劑），共3組，每組3只。

2.3.2 試驗方法及評價：采用同體左右側自身對比法進行實驗。24 h內滴眼給藥4次（間隔8 h），空白對照組家兔左眼結膜囊給予0.9%氯化鈉注射劑0.1 mL，供試品組家兔左眼結膜囊給予0.01%硫酸阿托品滴眼劑0.1 mL、對照高劑量組家兔左眼結膜囊給予0.05%硫酸阿托品注射劑0.08 mL，滴入后開合眼瞼使受試物與兔眼球充分接觸，保證藥物充分暴露，右眼不做處理。最后一次給藥后 1、2、4、24、48、72 h，再次對家兔進行眼刺激反應情況檢查。連續(xù)觀察21 d，每天對家兔雙眼進行檢查，每次檢查都詳細記錄兔眼部異常反應，根據眼刺激反應分值標準計算眼刺激反應分值，判斷眼刺激程度。

3 實驗結果

3.1 視網膜光線異常敏感試驗：各受試物組大鼠視網膜中MDA、T-SOD、GSH-PX和CAT的含量進行組間比較，均無顯著差異（P>0.05）。結果表明，0.01%硫酸阿托品對視網膜光線異常敏感試驗模型大鼠視網膜中MDA、T-SOD、GSH-PX和CAT含量無影響。結果見表3。

表3 受試物對視網膜光線異常敏感試驗模型大鼠視網膜中MDA、TSOD、GSH-PX 和 CAT 含量的影響（±s，n=20）Tab.3 Effects of the test substance on the retinal light abnormality test model rats MDA，T-SOD，GSH-PX and CAT contents（±s，n=20）

表3 受試物對視網膜光線異常敏感試驗模型大鼠視網膜中MDA、TSOD、GSH-PX 和 CAT 含量的影響（±s，n=20）Tab.3 Effects of the test substance on the retinal light abnormality test model rats MDA，T-SOD，GSH-PX and CAT contents（±s，n=20）

組別 M D A（m m o l/g p r o t）T-S O D（U/m g H b）G S H-P X（U/m g p r o t）C A T（U/m g p r o t）空白對照組供試品組對照高劑量組1 0 9.3 6±5.9 6 1 1 4.8 6±8.2 3 1 0 6.1 8±1 1.1 2 3 3 5.1 3±2 9.1 0 2 9 6.0 1±2 3.1 7 3 1 8.7 7±3 1.2 8 6 4 3.9 9±6 6.8 1 6 7 3.4 5±4 1.5 9 6 7 7.7 4±3 4.6 9 1 5 2 6.5 1±1 2 7.7 8 1 5 1 9.0 1±1 1 6.0 4 1 5 2 8.5 5±1 3 5.5 1

3.2 眼壓檢測試驗：結果顯示，所測得給藥后家兔眼壓均在家兔眼壓正常值范圍內。結果表明，受試物對家兔眼壓無影響。結果見表4。

表1 眼刺激反應分值標準Tab.1 Eye irritation response score criteria

表2 眼刺激性評價標準Table 2 Evaluation criteria for eye irritation

表4 受試物對家兔眼壓的影響Table 4 Effects of test substances on intraocular pressure in rabbits

3.3 急性眼刺激性試驗：根據表3、表4，對家兔給藥期間及觀察期觀察顯示，受試物對家兔眼角膜、結膜、虹膜均未造成損傷，眼部未發(fā)生水腫反應，同時，眼部也并未因給藥而出現分泌物增多、分泌物黏稠等癥狀，結果表明，受試物未對家兔眼部給藥部位產生刺激性。

4 討論

0.01%硫酸阿托品滴眼液對視網膜光線異常敏感試驗模型大鼠視網膜中的MDA、T-SOD、GSH-PX和CAT等內源性物質的含量無影響；0.01%硫酸阿托品滴眼液滴眼給藥后對家兔眼壓無影響；0.01%硫酸阿托品滴眼液對家兔眼部不產生刺激性，不損傷家兔眼部角膜、結膜、虹膜等組織器官，不會誘發(fā)家兔眼部水腫反應。