隋建樞，陳天青，王 偉，羅永露，劉 林，何慶才

(1.貴州省旱糧研究所, 貴陽 550006； 2.貴州大學(xué)生命科學(xué)院，貴陽 550025；3.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 貴陽 550006)

小麥?zhǔn)琴F州唯一的夏收糧食作物，解決貴州糧食生產(chǎn)中夏秋糧食空缺的問題發(fā)揮了重要作用。貴州省位于我國西南冬麥區(qū)，屬于自給型雨養(yǎng)農(nóng)業(yè)區(qū)，在小麥生長(zhǎng)期內(nèi)雨量較為充沛，氣候溫和濕潤(rùn)，易導(dǎo)致小麥病害的大發(fā)生。其中條銹病、白粉病是常發(fā)病，危害十分嚴(yán)重。近些年來，由于種植密度增大，水肥條件提高，使田間小氣侯變得有利于小麥葉銹病的發(fā)生，葉銹病的危害有逐漸增大的趨勢(shì)[1]。培育和推廣抗病品種被公認(rèn)為是防治小麥病害最經(jīng)濟(jì)、有效、安全的途徑。

DNA分子標(biāo)記是目前檢測(cè)小麥抗病性狀最為經(jīng)濟(jì)、高效的手段，它具有快速、準(zhǔn)確、不受環(huán)境條件限制等優(yōu)點(diǎn)。利用分子標(biāo)記輔助選擇，可以將許多優(yōu)良的抗病基因聚集起來，克服傳統(tǒng)育種的盲目性，加快育種進(jìn)程，縮短育種周期。

張?jiān)銎G等[2]利用小麥抗白粉病基因Pm4、Pm13、Pm21的特異PCR標(biāo)記，對(duì)含有Pm4b、Pm13、Pm21的小麥品系復(fù)合雜交F2代40個(gè)植株進(jìn)行檢測(cè)，從中選擇到Pm4b+Pm13+Pm21三個(gè)基因聚合的抗病植株11個(gè)，檢測(cè)、選擇到Pm4b+Pm13、Pm4b+Pm21、Pm13+Pm21兩個(gè)基因聚合的抗病植株19個(gè)。任曉利等[3]通過構(gòu)建抗葉銹基因Lr9-Lr26和Lr19-Lr20的復(fù)合PCR檢測(cè)體系，對(duì)116個(gè)小麥品種(系)所含有的抗葉銹病基因進(jìn)行了分子檢測(cè)。楊亨等[4]采用Yr5，Yr9，Yr10，Yr18及Yr26的分子標(biāo)記，對(duì)78份鑒定材料在2017—2018年國家冬小麥區(qū)試品種中可能含有的抗性基因進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，78份鑒定材料中，可能攜帶Yr5，Yr9，Yr10，Yr18及Yr26的材料數(shù)分別為0，21，5，1份及9份。

本研究針對(duì)小麥抗條銹病的Yr26基因、抗葉銹病的Lr34、Lr26基因進(jìn)行分子標(biāo)記檢測(cè)，期望從雜交小麥后代中篩選出同時(shí)含有2種或3種抗病基因的植株，為貴州小麥抗病育種提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 供試小麥

貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院旱糧研究所小麥課題組提供的小麥雜交后代F2～F4世代共337株。

1.2 引 物

Xgwm 18[5]、csLV 34[6]、IB-267[7]，由上海生工生物工程有限公司合成。見表1。

表1 引物信息及標(biāo)記類型

1.3 DNA的提取

采取植株嫩葉，做好標(biāo)記放入2 mL離心管中。用CTAB法提取基因組DNA[8]，用50μL去離子水溶解后保存在-20 ℃冰箱中備用。用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度，并用滅菌ddH2O將終濃度調(diào)至100 ng·μL-1，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PCR擴(kuò)增檢測(cè)

反應(yīng)體系10μL，其中含有10×Buffer 1μL，2.5 mM dNTPsMixture 0.8μL，10μM上下游引物各0.7μL，100 ng·μL-1DNA 1μL，5 U·μL-1DNATaq聚合酶0.2μL，補(bǔ)ddH2O 5.6μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 S，53～58 ℃(退火溫度因引物而異)退火30 S，72 ℃延伸45 S，40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 分子標(biāo)記的特異性檢測(cè)

用引物IB-267對(duì)供試小麥材料進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果見圖1。擴(kuò)增結(jié)果表明，337份小麥材料中有93份能擴(kuò)增出210 bp的目標(biāo)條帶，可判斷其含有抗葉銹病Lr26基因。用引物csLV 34 F/csLV 34 R對(duì)供試小麥材料進(jìn)行PCR檢測(cè)(圖2)共檢測(cè)出10份樣品能擴(kuò)增出150 bp的目標(biāo)條帶，可判斷其含有抗葉銹病Lr34基因。用引物Xgwm 18對(duì)供試小麥材料進(jìn)行PCR檢測(cè)(圖3)共檢出137份樣品能擴(kuò)增出193/215 bp的目標(biāo)條帶，可判斷其含有抗條銹病基因Yr26。

圖1 部分供試小麥材料Lr26標(biāo)記擴(kuò)增結(jié)果

圖2 部分供試小麥材料Lr34標(biāo)記擴(kuò)增結(jié)果

圖3 部分供試小麥材料Yr26標(biāo)記擴(kuò)增結(jié)果

2.2 檢測(cè)結(jié)果分析

從表2可以看出，在337份供試樣品中，抗條銹病Yr26基因的檢出率最高，為40.7%，抗葉銹病基因Lr26的檢出率為27.6%，抗葉銹病基因Lr34的檢出率較低，為3%。雙基因的檢出率分別為Yr26/Lr26為10.7%，Yr26/Lr34為0.6%，Lr34/Lr26為2.1%。而同時(shí)含有Lr34/Lr26/Yr26只有1份，檢出率為0.3%。

表2 分子標(biāo)記檢測(cè)情況

綜上所述，由于Lr34為抗葉銹病慢銹基因，在小麥抗病性植株選育中并沒有得到充分的重視。Yr26是抗條銹病高抗基因，在沒有?；拘孕》N出現(xiàn)之前被長(zhǎng)期廣泛使用。檢測(cè)結(jié)果中雙基因與三基因檢出率并不高，由此可見，分子標(biāo)記技術(shù)更易幫助育種家在小麥雜交選育過程中聚合多個(gè)抗病基因，該技術(shù)的運(yùn)用可為小麥抗病品種的選育提供有力的支持。

3 討 論

1)小麥Yr26基因?qū)Τ齎 26菌系以外的所有條銹菌都具有良好抗性，在我國小麥條銹病育種中被廣泛利用。雖然隨著條銹菌新生理小種CYR 34的出現(xiàn)而喪失抗病性，但與其它抗條銹基因聯(lián)合使用，可減少單一抗源品種抗病性喪失帶來的危害。在本次供試樣品中檢出率較高，利用分子輔助標(biāo)記可以實(shí)現(xiàn)該基因的大規(guī)模檢測(cè)，可為小麥抗條銹病研究提供理論參考依據(jù)。

2)小麥Lr34基因?qū)儆诙嗫刮稽c(diǎn)基因，由Krattinger等[9]于2009年克隆，該位點(diǎn)分別對(duì)應(yīng)了Lr34(抗葉銹基因)、Yr18(抗條銹基因)、Sr57(抗桿銹基因)和Pm38(抗白粉基因)，是很好的抗葉銹病慢銹基因，至今仍未發(fā)現(xiàn)明顯的小種?；?，但我國小麥育種材料中含Lr34抗葉銹病基因頻率極低。本次研究的檢出情況也印證了以往的報(bào)道。在高病害壓力下Lr34單獨(dú)存在時(shí)抗性還不夠強(qiáng)，但與其他抗葉銹基因聚合時(shí)，則會(huì)表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗性[10]。該基因位點(diǎn)與多種病害的抗性相關(guān)，在小麥抗病育種中應(yīng)該加強(qiáng)利用，充分發(fā)掘其抗病價(jià)值。

3)小麥抗葉銹病基因Lr26位于1 BL/1 RS易位系上，是我國20世紀(jì)80年代的主要抗源，曾被育種家廣泛使用。雖然目前Lr26單獨(dú)使用已經(jīng)喪失抗性，但與其他抗病基因組合使用時(shí)，仍然具有很好的抗病效果。