夏 峰

(南京醫(yī)科大學(xué)康達學(xué)院，江蘇 連云港 222000)

酶作為一種生物大分子催化劑，具有高效、專一、溫和、綠色等特點，在各個領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用，并且被逐步提高到戰(zhàn)略應(yīng)用的高度[1-2]。雖然酶具有如此優(yōu)越的性能，但游離酶的使用經(jīng)常受到環(huán)境的限制，穩(wěn)定性不好且不能重復(fù)使用，而將酶固定化后則可以將酶有效地從反應(yīng)體系中分離出來，從而提高酶的穩(wěn)定性并可多次使用[3-5]。漆酶是一種單電子氧化還原酶，含有四個銅離子且銅離子是其活性中心的重要組成部分，穩(wěn)定性較好，底物專一性寬泛，在有機藥物、生物傳感器、廢水處理等鄰域被廣泛應(yīng)用[6-9]。作為催化劑的載體，介孔分子篩具有較大的比表面積和孔容，是一種非常有前途的固定化酶載體[10]，與SBA-15和MCM-41相比，SBA-16是一類孔道規(guī)整，具有超大籠狀的 Im3m型體心立方結(jié)構(gòu)材料[11]，其較厚的孔壁、高的比表面積和熱穩(wěn)定性，尤其是其三維孔道的連通性更有利于物料的傳輸及反應(yīng)物及產(chǎn)物的擴散，使得SBA-16在催化、吸附、分離和生物大分子的固定等方面有著良好的應(yīng)用前景。本文以SBA-16為載體，用銅離子對其進行改性，然后通過吸附漆酶制備了一種固定化漆酶，結(jié)果顯示，Cu/SBA-16固定化漆酶的活性與Cu2+負載量呈現(xiàn)出一定的正相關(guān)性。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

微量天平，搖床，pH計，Biomate 3S紫外分光光度計，離心機。

1.2 試劑

漆酶，SBA-16分子篩，乙酸銅，Na2HPO4·12H2O，NaH2PO4·2H2O， 2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(簡稱ABTS)。

2 實驗方法

2.1 Cu/SBA-16制備

稱取五份0.1 g的SBA-16，分別懸浮于10 ml Cu2+濃度為10、20、30、40、50 mmol/L的乙酸銅水溶液中，室溫下浸漬24 h，然后過濾，去離子水洗滌，干燥得到藍色樣品，記為Cu/SBA-16。

2.2 漆酶的固定化

將0.1 g的SBA-16或Cu/SBA-16加到10 mL系列不同濃度漆酶的0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液中，以160 r/min的轉(zhuǎn)速搖晃20 h，然后離心，用磷酸鹽緩沖液洗滌固體多次，直到離心液中檢測不到酶活，所得固定化漆酶記為M/SBA-16和M/Cu/SBA-16。

2.3 游離酶及固定化酶活性的檢測

游離酶活性的檢測：取一定濃度的游離漆酶溶液與1.0 mmol/L的ABTS溶液進行等體積反應(yīng)，以適當(dāng)pH值的0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液為反應(yīng)體系，紫外分光光度計測定體系在4 min內(nèi)420 nm處的吸光度變化情況，吸光度變化越大，酶的活性越高。

固定化酶活性的檢測：稱0.1 g上述固定化漆酶，依次加入4 mL適當(dāng)pH值的0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液和2 mL 1.0 mmol/L的ABTS溶液，反應(yīng)3 min后，馬上置于冰水浴中停止反應(yīng)，然后檢測上清液在420 nm處的吸光度變化情況。

3 結(jié)果與討論

3.1 最適pH值

酶的活性與反應(yīng)體系的pH值有很大關(guān)系，不同pH值體系對游離漆酶活性的影響如圖1所示[12]。本實驗中漆酶可以催化ABTS生成一種藍色物質(zhì)，酶的活性越高，生成的藍色物質(zhì)顏色越深，其吸光度也越大，即酶的活性與反應(yīng)體系的吸光度變化成正比。從圖中可以看到，隨著反應(yīng)的進行，不同pH值體系的吸光度值均不斷增大，但其增大的速度卻不相同，其中，pH值為3的反應(yīng)體系的吸光度增大地最快，說明此時漆酶的活性是最高的，即游離漆酶的最適pH值為3左右。

圖1 pH值對漆酶活性的影響

3.2 載酶量對固定化漆酶活性的影響

在最適pH值下配制不同濃度的漆酶溶液，然后在SBA-16上進行固定化，得到不同載酶量的M/SBA-16，然后用分光光度計檢測固定化漆酶的活性，結(jié)果如圖2所示，M/SBA-16的活性隨著載酶量的提高先快速升高然后趨于穩(wěn)定，當(dāng)載酶量為96 mg/g時，M/SBA-16的活性達到較高水平，繼續(xù)增大載酶量，M/SBA-16的活性變化不大，這可能是由于太多的漆酶分子堆積于SBA-16分子篩孔道內(nèi)，影響了反應(yīng)物質(zhì)的擴散與傳輸。與SBA-15的負載量(48 mg/g)相比[12]，SBA-16具有三維立體孔道結(jié)構(gòu)，因此其具有更高的酶負載量。

圖2 載酶量對固定化漆酶活性的影響

3.3 Cu2+對固定化漆酶活性的影響

圖3 Cu2+對固定化漆酶活性的影響

Cu2+作為漆酶活性中心的重要組成部分，對漆酶的活性有重要影響。在最適pH值與最佳載酶量下，本文制備了不同Cu2+含量的M/Cu/SBA-16并考察其對漆酶活性的影響。結(jié)果如圖3所示，負載Cu2+后，M/Cu/SBA-16固定化漆酶的活性與Cu2+濃度呈現(xiàn)一定的正相關(guān)性，隨著Cu2+濃度的升高，固定化漆酶的活性隨之升高，但Cu2+濃度上升到一定程度后，固定化漆酶的活性不再升高，這可能是由于高濃度的Cu2+并沒有有效提高Cu2+在SBA-16上的負載量，因此相應(yīng)的固定化酶的活性也不再升高。

進一步研究表明，純SBA-16載體以及當(dāng)Cu2+單獨負載于SBA-16上時并不會對底物ABTS有催化作用，結(jié)果如表1所示。由此可見，所制備的固定化酶M/Cu/SBA-16中，漆酶是發(fā)揮催化作用的主要因素，而Cu2+對固定化酶具有促催化作用。

表1 不同催化劑的相對活性

4 結(jié)論

SBA-16具有超大籠狀的立方結(jié)構(gòu)，具有較高的比表面積和熱穩(wěn)定性，其三維孔道的連通性更有利于物料的傳輸及反應(yīng)物及產(chǎn)物的擴散，是一種性能優(yōu)異的固定化酶載體。通過本文的研究，漆酶通過物理吸附法可以固定于SBA-16的孔道內(nèi)，其最適pH值為3左右，最佳載酶量為96 mg/g左右。負載Cu2+后，Cu2+對固定化酶M/Cu/SBA-16具有促催化作用，且固定化漆酶的活性隨著Cu2+濃度的升高而升高，但Cu2+濃度上升到一定程度后，固定化漆酶的活性不再升高。