胡澤明，汪清志，張建康，鐘佳寧，陳 斌

（1.贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院；2.贛南醫(yī)學(xué)院2019級碩士研究生；3.贛南醫(yī)學(xué)院科研中心，江西 贛州 341000）

Hedgehog（Hh）信號通路是于1980 年首次在黑腹果蠅的節(jié)段發(fā)育中發(fā)現(xiàn)的一條高度保守的信號通路。這一通路在胚胎發(fā)育及組織形成過程中發(fā)揮著重要的角色，后來又研究發(fā)現(xiàn)在維持成人機體中的干細(xì)胞、組織穩(wěn)態(tài)、造血和免疫系統(tǒng)也起著關(guān)鍵作用。已有大量的研究發(fā)現(xiàn)Hh 分子信號通路還涉及了多種癌癥的發(fā)生與發(fā)展［1］。經(jīng)典的Hh 信號通路通過三種Hh 配體的釋放而促發(fā)，即：Sonic Hh配體（SHH）、Desert Hh 配體（DHH）和Indian HH 配體（IHH）。在沒有以上三種Hh 配體的分泌時，PTCH1 受體（一種12 次跨膜蛋白受體）會抑制Smoothened（SMO）受體（一種G蛋白偶聯(lián)受體）的活性從而使Hh 信號通路處于失活態(tài)［2］。而當(dāng)有Hh 配體的分泌時，其會與PTCH1 受體結(jié)合并解除了對SMO 受體的抑制作用，從而導(dǎo)致該信號通路的下游效應(yīng)因子GLI在細(xì)胞膜初級纖毛微管突起處的磷酸化和核易位，并誘導(dǎo)其靶基因包括細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶和生長因子等的表達(dá)［3］。

GLI 轉(zhuǎn)錄因子是Kruppel 家族的成員，也是Hh信號通路的主要效應(yīng)因子。在脊椎動物中鑒定出的GLI 轉(zhuǎn)錄因子家族有3 種分別是Gli1、Gli2 和Gli3，然而在果蠅中只發(fā)現(xiàn)一種GLI 蛋白。所有的GLI蛋白均含有高度保守的C2H2-Kruppel型鋅指結(jié)構(gòu)域和組氨酸-半胱氨酸連接序列，能與靶基因啟動子上的一致序列GACCACCCA 結(jié)合，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡［4］。同時，已有大量的研究表明GLI蛋白的異常表達(dá)與多種癌癥的進(jìn)展密切相關(guān)［5］。然而，GLI 調(diào)控惡性腫瘤的進(jìn)展及其作為潛在的腫瘤治療靶點的應(yīng)用價值分析目前未見系統(tǒng)綜述。因此，本文就GLI 基因在腫瘤進(jìn)展中的作用及其抑制劑的抗腫瘤效應(yīng)作一綜述，旨在為治療腫瘤患者提供一種可靠的靶標(biāo)。

1 GLI基因與腫瘤發(fā)生發(fā)展

已有研究證實Gli1和Gli2的轉(zhuǎn)錄激活可能在多種腫瘤的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。關(guān)于Gli1 對于腫瘤形成的作用研究已經(jīng)非常深入，Gli1 的異常表達(dá)對基底細(xì)胞癌（basal cell carcinoma，BCC）［6］至關(guān)重要，而一些腫瘤包括頭頸癌、肺癌、消化道腫瘤、乳腺癌、前列腺癌、髓母細(xì)胞瘤和黑色素瘤等也與Gli1過表達(dá)密切相關(guān)。如表1 所示，Gli1 在多種惡性腫瘤中都呈過表達(dá)，這足以說明Gli1 基因與腫瘤的發(fā)生關(guān)系緊密。此外，一項Meta 分析顯示，除了顱內(nèi)腫瘤外，在大多數(shù)實體惡性腫瘤中，Gli1過表達(dá)通常提示預(yù)后較差［7］。一項獨立研究也證實了在以高復(fù)發(fā)、高轉(zhuǎn)移性、預(yù)后極差為特征的三陰性乳腺癌中SMO 和Gli1 均過表達(dá)［8］。同時還有研究表明，Gli2過表達(dá)通過相反的上皮細(xì)胞周期停滯信號傳導(dǎo)和表皮分化的方式參與Hh 配體誘導(dǎo)的上皮內(nèi)瘤變，此項研究還顯示Gli2 也參與了BCC 的侵襲與轉(zhuǎn)移［9］。

GLI 參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的機制涉及多種途徑中的靶基因表達(dá)來誘導(dǎo)。如圖1所示，GLI通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期蛋白D1 和D2（Cyclin D1、Cyclin D2）、胰島素樣生長因子2（IGF2）、N-MYC、HES1 等基因的表達(dá)來提高腫瘤細(xì)胞的增殖能力［27］；通過誘導(dǎo)B 細(xì)胞淋巴瘤2（BCL2）基因的表達(dá)來調(diào)節(jié)細(xì)胞存活；通過誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和血管生成素（angiopoietin）的表達(dá)促進(jìn)血管生成［28］；通過誘導(dǎo)p53 基因破壞遺傳的穩(wěn)定性［29］；通過誘導(dǎo)SNAG1鋅指蛋白的表達(dá)促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）進(jìn)而增強腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移潛能［30］；通過調(diào)控干基因NANOG 和SOX2 的表達(dá)促進(jìn)干細(xì)胞的自我更新［31］。此外，腫瘤的新生血管對腫瘤細(xì)胞的營養(yǎng)和代謝廢物的清除具有重要意義，并不斷促進(jìn)腫瘤向惡性進(jìn)展。有報道認(rèn)為，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中Hh-Gli1 信號通路是異常激活的，還可誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶2/9（MMP-2 和MMP-9）和VEGF 的表達(dá)來促進(jìn)腫瘤血管生成［32］。

表1 GLI在多種類型的癌癥中過表達(dá)

圖1 GLI通過多種途徑促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展

EMT 時常發(fā)生在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程中，主要受腫瘤微環(huán)境和炎癥介質(zhì)的調(diào)控。發(fā)生EMT 的細(xì)胞通常表現(xiàn)為鈣粘蛋白（E-cadherin）下調(diào)，以及波形蛋白（vimentin）和纖連蛋白（fibronectin）的上調(diào)，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞更容易侵犯基底膜和血管，最終促發(fā)腫瘤的轉(zhuǎn)移。最近的一項對胃癌中GLI 與EMT相關(guān)基因的研究表明，Gli1 過表達(dá)與Snail 的上調(diào)及E-cadherin 的下調(diào)密切相關(guān)［33］。此外，另有研究認(rèn)為Gli1 和Gli2 可通過降低E-cadherin 的表達(dá)來誘導(dǎo)EMT并促進(jìn)肺腺癌［34］的侵襲和轉(zhuǎn)移。

2 GLI基因與腫瘤干細(xì)胞

原發(fā)腫瘤行手術(shù)切除后的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是當(dāng)今世界治療癌癥的兩大難題，一些腫瘤患者在經(jīng)歷較長時間的無疾病生存期后仍會出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)的情況。其中有一種科學(xué)假說認(rèn)為在腫瘤患者中存在著一些特殊的癌細(xì)胞亞群，它們被賦予了干細(xì)胞的特征。腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cells，CSC）具有產(chǎn)生大部分腫瘤中所有細(xì)胞類型的能力，因此能夠引發(fā)繼發(fā)性腫瘤的形成。有大量的研究表明，Hh信號通路可以驅(qū)動CSC 在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、多發(fā)性骨髓瘤和慢性粒細(xì)胞白血病中的維持［35］。GLI 蛋白通過調(diào)節(jié)CSC中的干基因如NANOG、OCT4、SOX2、WNT-2、CD44和Kruppel 樣因子4（KLF4）的表達(dá)而有助于CSC 細(xì)胞亞群的維持［36］。因此，有學(xué)者研究出阻斷Hh 信號通路可以抑制髓母細(xì)胞瘤中CSC 的增殖及自我更新能力［37］。相似的是，SINGH 等［38］也證明了抑制Hh-GLI 信號通路會明顯提高胰腺癌中CSC 的凋亡率。與這些結(jié)果一致的是，有研究發(fā)現(xiàn)特異的針對Gli1 和Gli2 的siRNA 轉(zhuǎn)染降低了BMI-1 介導(dǎo)的乳腺癌中CSC 的自我更新能力［39］。VARNAT 等［40］分析了40 例結(jié)腸癌患者，證實了在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中，CSC 中的Gli1 水平在持續(xù)升高，這進(jìn)一步支持了GLI 與CSC 的相關(guān)性。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)表皮生長因子受體（EGFR）傳導(dǎo)和Gli1 之間的共同協(xié)作影響了非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）中CSC 的干細(xì)胞樣功能，這提示了一種EGFR 突變的NSCLC 的治療新策略［31］。

3 GLI抑制劑

靶向Hh-GLI 信號通路是近年來治療腫瘤的新策略。最初，Hh-GLI 信號通路以SMO 水平為靶點來研究抑制劑，試圖繞過常在Hh 相關(guān)的腫瘤（如髓母細(xì)胞瘤和BCC）中失活的PTCH1 基因。環(huán)巴胺（Cyclopamine），一種源自某種植物的天然甾體生物堿，是第一種被發(fā)現(xiàn)的SMO抑制劑。由于Cyclopamine的溶解度和藥代動力學(xué)性能較差，并不適用于臨床，因此就有許多Cyclopamine 的衍生物被開發(fā)出來，以提高其特異性和療效。目前為止，兩種SMO抑制劑（LDE225/sonidegib 和GDC-0449/vismodegib）已被FDA 批準(zhǔn)用于治療BCC 患者，而且一些臨床試驗正在進(jìn)行評估當(dāng)它們用于其他腫瘤患者后的療效。不幸的是，使用SMO 抑制劑的一些腫瘤患者出現(xiàn)了耐藥性，其耐藥性的機制可能包括SMO 的突變、Gli2的擴(kuò)增以及PI3K/AKT 等協(xié)同信號通路的表達(dá)上調(diào)。因此，有學(xué)者提出通過研究具有不同作用機制的第二代SMO 抑制劑，即SMO 下游的GLI 抑制劑，可解決SMO突變造成的耐藥性問題。

3.1 GANT58 和GANT61GANT58 和GANT61是小分子GLI 拮抗劑，可干擾GLI 與高度保守的DNA 序列結(jié)合，但GANT61 對GLI的特異性更高，能更有效地阻斷GLI 與DNA 的序列結(jié)合。這兩種抑制劑在體外能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，在體內(nèi)能抑制腫瘤組織的生長。例如，GANT61 在肺癌異種移植瘤模型［41］、急性髓系白血?。?2］、橫紋肌肉瘤［43］、神經(jīng)母細(xì)胞瘤［44］、乳腺癌［45］、胰腺癌［46］中均顯示出GLI特異性的抗腫瘤作用。此外，也有研究報道了這兩種抑制劑可以影響G1/S 期的細(xì)胞周期停滯。最近又發(fā)現(xiàn)GANT61 還有其他作用包括：誘導(dǎo)DNA 雙鏈斷裂、刺激線粒體產(chǎn)生活性氧（ROS）、減緩EMT 的發(fā)生以及誘導(dǎo)自噬的形成。同時有學(xué)者發(fā)現(xiàn)應(yīng)用GANT61 處理后會影響GLI 靶基因的表達(dá)，如人類端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（TERT），進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖潛能［47］。

通過比較SMO 抑制劑和GLI 抑制劑可以明顯看出，GLI 抑制劑在腫瘤治療中更為有效。例如，BENVENUTO 等［45］在裸鼠異種移植瘤模型中比較了兩種抑制劑在乳腺癌生長中的作用，其研究數(shù)據(jù)表明GANT61 的抑制作用比GDC-0449 更為明顯。相似的結(jié)果也在來源于最常見和最具侵襲性的18 種細(xì)胞系上得到證明，并一致認(rèn)為GANT61 比SMO 抑制劑更有效［48］。此外，在博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠模型中也發(fā)現(xiàn)GLI 抑制劑比SMO 抑制劑更為敏感［49］。在橫紋肌肉瘤［43］、膽道惡性腫瘤［50］、神經(jīng)母細(xì)胞瘤［44］和慢性淋巴細(xì)胞白血?。?1］的體內(nèi)外實驗中，GANT61均被證明比Cyclopamine更為有效。

3.2 ATO三氧化二砷（ATO）已被FDA 批準(zhǔn)成為急性早幼粒細(xì)胞白血病（APL）的患者對反式維甲酸治療無效或復(fù)發(fā)的第二種治療方案。該藥物會直接與GLI 相互作用，并抑制其活性從而下調(diào)GLI 靶基因的表達(dá)。KIM 等發(fā)現(xiàn)ATO 通過阻止Gli2 從初級纖毛上轉(zhuǎn)運的方式而抑制其活化。HAN 等［52］認(rèn)為ATO可能是通過取代GLI鋅指蛋白中的鋅離子并使其失活，從而成為Hh-GLI分子通路的抑制劑。關(guān)于ATO 的抗腫瘤作用在臨床治療中也有研究，YANG 等［53］研究發(fā)現(xiàn)，86%的APL 患者經(jīng)ATO 治療后病情得到緩解，這些患者的Gli2 和SMO 基因表達(dá)明顯下調(diào)，PTCH1 和GLI1 的基因表達(dá)輕微下調(diào)。ATO 可直接靶向GLI轉(zhuǎn)錄因子治療復(fù)發(fā)性和難治性的橫紋肌肉瘤。更有趣的是，ATO 與伊曲康唑的協(xié)同組合治療比單獨使用這兩種藥物更能下調(diào)Gli1的表達(dá)［54］。

3.3 Glabrescione BGlabrescione B（GlaB）是一種天然存在于豆科植物種子中的異黃酮，它被認(rèn)為是通過與Gli1 結(jié)合后并干擾其與DNA 之間的相互作用，從而減弱GLI 活性的新型小分子。GlaB 由于對Gli1 的活性有較強的抑制作用，在體內(nèi)外實驗中均可抑制Gli1 依賴性的腫瘤細(xì)胞生長，并抑制CSC的自我更新能力和克隆原性［55］。

3.4 Pirfenidone吡非尼酮（Pirfenidone）是PI3K/AKT 信號通路的特異性抑制劑，并通過該通路下調(diào)Gli1 的表達(dá)［56］。Pirfenidone 是一種抗纖維化藥物，對特發(fā)性肺纖維化的患者治療效果顯著，因為該藥具有明顯的抗炎、抗氧化和抗纖維化作用。Pirfenidone 也可以選擇性地破壞Gli2 的穩(wěn)定性，從而阻斷Hh 和TGF-β 分子信號通路的激活。由于這兩種信號通路都有利于腫瘤的發(fā)生發(fā)展，因此Pirfenidone 對與GLI 相關(guān)的腫瘤具有拮抗作用。事實上，最近的一些研究表明Pirfenidone 用于治療肺癌、乳腺癌等惡性腫瘤是一種有希望的抗腫瘤藥物［57］。此外，MIURA 等［58］的一項研究表明，特發(fā)性肺纖維化的患者在接受Pirfenidone 治療后其肺癌發(fā)病率明顯降低。

3.5 HPIsHPIs（HPI-1、HPI-2、HPI-3 和HPI-4）已被認(rèn)為是一種針對GLI 的Hh 信號通路抑制劑。研究表明，HPIs 在SMO 的下游起作用，影響GLI 的穩(wěn)定性、降解速度以及GLI 向初級纖毛的轉(zhuǎn)運［59］。經(jīng)過高通量篩選，HPI-1 被認(rèn)定為是一種能夠拮抗SMO 激動劑（SAG）所誘導(dǎo)的GLI 靶基因表達(dá)的化合物。HPI-1 也可通過靶向GLI 蛋白的翻譯后修飾或轉(zhuǎn)錄因子與輔助因子之間的相互作用從而阻斷Hh信號通路的激活。有學(xué)者研究出可以將HPI-1 包裹在聚乙二醇（PEG）偶聯(lián)的聚乳酸-糖基乙酸（PLGA）納米顆粒中，并成功應(yīng)用于髓母細(xì)胞瘤和胰腺癌的小鼠異種移植瘤模型中［60］。

3.6 其他GLI抑制劑針對GLI的其他Hh通路抑制劑還有咪喹莫特（Imiquimod）、納米奎納克林（nanoquinacrine，NQC）和撲蟯靈（Pyrvinium）等。咪喹莫特是Toll樣受體7/8（TLR7/8）的激動劑，通過與腺苷受體（ADORAs）的相互作用來激活蛋白激酶A（PKA），從而促進(jìn)Gli2的磷酸化和降解［61］。NQC，奎納克林（一種抗癌藥）的球狀納米顆粒，已被證明以多種方式干擾Hh-GLI 分子通路的表達(dá)。NQC 會增強GSK3β 和PTEN 負(fù)向調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，還會干擾Gli1 與DNA 結(jié)合序列之間的結(jié)合，從而增強Gli1-DNA 復(fù)合物的不穩(wěn)定性。因此，已有研究證明NQC可以影響Gli1 依賴的細(xì)胞增殖和腫瘤生長［62］。Pyrvinium 是一種已被FDA 批準(zhǔn)的抗蠕蟲藥物，已被證實可降低GLI 轉(zhuǎn)錄因子的穩(wěn)定性。Pyrvinium 作為CK1 的變構(gòu)激活劑，促進(jìn)了CK1 與Gli1 的結(jié)合，并導(dǎo)致Gli1 的磷酸化和隨后的蛋白酶體降解［63］。此外，組蛋白去乙?；?（HDAC6）在髓母細(xì)胞瘤中可以調(diào)節(jié)Gli2 的mRNA 和Gli3 的蛋白表達(dá)，因此HDAC6 抑制劑可能是Hh 相關(guān)腫瘤中新的潛在靶點［64］。阿司匹林（aspirin）作為一種廣泛應(yīng)用于臨床的解熱鎮(zhèn)痛抗炎藥，對Hh-GLI信號通路也有抑制作用，能夠使惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞對替莫唑胺（temozolomide）的化療更敏感［65］。

總結(jié)以上各種GLI抑制劑及其在腫瘤中的效應(yīng)見表2，其中只有ATO、Pirfenidone 和Imiquimod 已經(jīng)進(jìn)入了不同類型癌癥的臨床試驗。除了白血病外，ATO 也被用于在SMO 抑制劑治療后復(fù)發(fā)的BCC 患者［66］。Pirfenidone 的Ⅱ期臨床試驗顯示Pirfenidone對成神經(jīng)細(xì)胞瘤的患者有益，大部分患者的無疾病進(jìn)展期延長，部分患者的腫瘤體積縮小了15%［67］。Imiquimod也已經(jīng)在BCC、乳腺癌和宮頸癌患者中進(jìn)行了臨床測試［68-69］。在乳腺癌中，局部應(yīng)用Imiquimod的患者具有良好的耐受性，并可誘導(dǎo)疾病的消退。然而在宮頸癌中的試驗結(jié)果存在爭議，一些患者在應(yīng)用Imiquimod 后沒有效果甚至病情還得到惡化，另一些患者則有效地緩解了疾病進(jìn)展，因此未來需要更多的臨床研究來驗證Imiquimod的療效。

表2 GLI抑制劑及其在各種腫瘤中的作用

4 總結(jié)與展望

GLI 蛋白是經(jīng)典的Hh 信號通路下游的調(diào)控因子，異常激活的GLI 在諸多癌癥中經(jīng)常發(fā)生，同時GLI會通過調(diào)節(jié)一些靶基因促進(jìn)細(xì)胞增殖、存活、血管生成、遺傳不穩(wěn)定性、EMT 和干細(xì)胞的自我更新等方式參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。此外，GLI 在CSC的調(diào)節(jié)中也發(fā)揮了關(guān)鍵作用。因此，GLI 已然成為了治療腫瘤的最具吸引力的新靶標(biāo)。目前針對GLI靶點開發(fā)的抑制劑也越來越多，其各種抑制劑在體內(nèi)外實驗中都展現(xiàn)出了一種較好的前景，但只有3種GLI抑制劑進(jìn)入臨床試驗階段。未來的研究重點是需要開發(fā)出更多的GLI分子靶向藥物并在臨床試驗中進(jìn)一步驗證，為腫瘤患者的治療提供一種更安全有效的選擇。