周妙妮 林福全 吳辛剛 許愛(ài)娥

杭州市第三人民醫(yī)院皮膚科310009

Fam114A1（family with sequence similarity 114 member A1）基因編碼的蛋白屬于Fam114 家族，又名為Noxp20，在神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育中起重要作用［1］。Fam114A1 蛋白廣泛分布于機(jī)體組織，包括皮膚組織，其基因突變與強(qiáng)直性脊柱炎及自身免疫性腸炎的發(fā)病有一定相關(guān)性［2］，但均為基因水平的相關(guān)研究，在不同組織、細(xì)胞中生物學(xué)功能的研究目前尚未見(jiàn)報(bào)道。黑素細(xì)胞屬于神經(jīng)嵴來(lái)源的細(xì)胞，與神經(jīng)細(xì)胞有一定的生物學(xué)共性，黑素細(xì)胞發(fā)育及功能異常會(huì)引起一系列色素性疾病，如泛發(fā)性色素異常癥［3］、斑駁?。?］等。Fam114A1是否參與黑素細(xì)胞的發(fā)育以及功能調(diào)控，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。本文從多方面研究Fam114A1 基因?qū)谒亓黾?xì)胞A375 生物學(xué)功能的影響，初步探討其對(duì)黑素細(xì)胞生物學(xué)功能可能的調(diào)控作用。

材料與方法

1.主要試劑和材料：A375細(xì)胞（天津賽爾生物技術(shù)有限公司）；胰蛋白酶、DMEM 培養(yǎng)基、Opti?MEM 培養(yǎng)基、胎牛血清（美國(guó)Gibco 公司）；磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）、酪氨酸酶（TYR）、酪氨酸酶相關(guān)蛋白1（TYRP?1）、前黑素小體蛋白（PMEL）、小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（MITF）、多巴色素異構(gòu)酶（DCT）、Fam114A1 抗體（美國(guó)BD 公司），MTT 細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Ameresco 公司），Transwell小室（美國(guó)Milipore公司）。

2. 建立穩(wěn)定過(guò)表達(dá)和抑制Fam114A1 蛋白的A375 細(xì)胞株：構(gòu)建Fam114A1 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pSR?CMV?GFP/Fam114A1 和抑制質(zhì)粒pRNT?U6.2?lenti?Fam114A1，并包被慢病毒，分別作為過(guò)表達(dá)組和表達(dá)抑制組，以轉(zhuǎn)染空載慢病毒的A375 細(xì)胞作為對(duì)照組。慢病毒感染前1天接種2×105A375細(xì)胞于24 孔板，每孔細(xì)胞融合達(dá)60%～80%時(shí)，將病毒液（感染復(fù)數(shù)MOI=20）加入含8 μg/ml溴化己二甲銨的DMEM培養(yǎng)基24 h，之后更換為不含溴化己二甲銨的DMEM完全培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)48 h，通過(guò)熒光顯微鏡觀(guān)察慢病毒轉(zhuǎn)染效率［綠色熒光蛋白（GFP）陽(yáng)性細(xì)胞/總細(xì)胞數(shù)］，然后裂解細(xì)胞檢測(cè)Fam114a1蛋白表達(dá)量，驗(yàn)證過(guò)表達(dá)和抑制Fam114a1 蛋白的效果。再將對(duì)照組、過(guò)表達(dá)組和表達(dá)抑制組A375細(xì)胞分別稀釋為1 000個(gè)/ml的單細(xì)胞懸液，用有限稀釋法篩選獲得能穩(wěn)定過(guò)表達(dá)或抑制Fam114a1蛋白的A375單克隆細(xì)胞。單克隆細(xì)胞在完全培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，獲得單克隆細(xì)胞系。

3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)黑素合成相關(guān)基因TYR、TYRP?1、PMEL、MITF、DCT mRNA 的表達(dá)：Trizol 法提取各組細(xì)胞總RNA。2 μg 總RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再行熒光定量PCR 檢測(cè)。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計(jì)和合成，引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)體系20 μl，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性1 min、60 ℃退火1 min、72 ℃延伸2 min，共30 個(gè)循環(huán)。以GAPDH 為內(nèi)參，結(jié)果采用2-△△Ct表示，△Ct = Ct目的基因－Ct內(nèi)參基因，△△Ct =△Ct過(guò)表達(dá)組或表達(dá)抑制組－△Ct對(duì)照組，每個(gè)樣本重復(fù)3次，取平均值。

正向引物序列TGAAGGTCGGAGTCAACGGA GCAAAGCATACCATCAGCTCA TCTCTGGGCTGTATCTTCTTCC AGGTGCCTTTCTCCGTGAG CTCACAGCGTGTATTTTTCCCA AACTGCGAGCGGAAGAAACC反向引物序列CCTGGAAGATGGTGATGGGAT GCAGTGCATCCATTGACACAT GTCTGGGCAACACATACCACT AGCTTCAGCCAGATAGCCACT ACTTTCGGATATAGTCCACGGAT CGTAGTCGGGGTGTACTCTCT基因GAPDH TYR TYRP1 PMEL MITF DCT

4.Western 印跡法檢測(cè)Fam114A1 及黑素合成相關(guān)蛋白的表達(dá)：提取各組細(xì)胞總蛋白，用含β 巰基乙醇5×上樣緩沖液煮沸變性。取適量蛋白樣品進(jìn)行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干轉(zhuǎn)膜。室溫?fù)u動(dòng)封閉2 h，加入1∶1 000 TBST 緩沖液稀釋的GAPDH、TYR、MITF、Fam114A1 抗體，4 ℃過(guò)夜。1×TBST 溶液洗膜4次，加入緩沖液稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG 二抗，室溫作用1.5 h。1×TBST溶液洗膜4次，顯色劑作用30 s后，暗室中曝光、顯影和定影處理。用LabWorksTM凝膠成像及分析系統(tǒng)拍攝膠片，目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。

5.MTT 法檢測(cè)A375 細(xì)胞增殖活性：將各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于96孔板，每組5孔，2 000個(gè)細(xì)胞/孔，48 h 后每孔加入10 g/L MTT 溶液10 μl。4 h后棄去原培養(yǎng)基，加入100 ml DMSO，搖床振蕩10 min。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490 nm 波長(zhǎng)處測(cè)量各孔A值（代表細(xì)胞增殖活性）。

6. 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)A375 細(xì)胞遷移能力：Transwell 小室底面涂0.5 g/L 纖維連接蛋白10 μl，超凈臺(tái)內(nèi)風(fēng)干備用。取105個(gè)細(xì)胞置于1.5 ml EP管中，200×g 離心5 min，去上清液，加入200 μl 無(wú)胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，加入小室中。下層小室加入含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后取出小室，徹底去除小室內(nèi)層細(xì)胞。小室外層細(xì)胞用甲醇/冰醋酸（3∶1）固定30 min，結(jié)晶紫染色15 min。清洗干凈并將膜固定于載玻片上，顯微鏡下選取3 個(gè)隨機(jī)100 倍視野拍照并計(jì)數(shù)細(xì)胞，取平均值作為遷移的細(xì)胞數(shù)。

7. 細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)A375 細(xì)胞黏附能力：0.2 g/L matrigel 膠包被96 孔板3 h，1×磷酸鹽緩沖液（PBS）輕洗2 遍，每孔加入0.5%牛血清白蛋白100 μl，置37 ℃孵箱中封閉2 h，1 × PBS 輕洗2 遍備用。用胰酶消化細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2.5 ×104/100 μl，將細(xì)胞懸液滴加至96 孔板中，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，置37 ℃孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)，90 min 后去除培養(yǎng)基和懸浮細(xì)胞，MTT 法測(cè)定490 nm 處A 值（代表細(xì)胞黏附能力）。

8.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 23.0軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料采用±s表示，多組的比較采用單因素方差分析，組間比較采用Dunnett?t檢驗(yàn)，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1.穩(wěn)定過(guò)表達(dá)和抑制Fam114A1 的A375 細(xì)胞株的建立：熒光顯微鏡觀(guān)察慢病毒轉(zhuǎn)染效率，對(duì)照組、過(guò)表達(dá)組和表達(dá)抑制組的轉(zhuǎn)染效率均在90%左右，見(jiàn)圖1A。Western 印跡結(jié)果顯示，3 組A375 細(xì)胞中Fam114A1 蛋白相對(duì)表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=50.088，P=0.000 2），過(guò)表達(dá)組（1.507±0.170）顯著高于對(duì)照組（0.850 ± 0.120，t = 5.888，P =0.001），表達(dá)抑制組（0.397 ± 0.120）顯著低于對(duì)照組（t = 4.065，P = 0.007），見(jiàn)圖1B。進(jìn)一步篩選單克隆細(xì)胞，成功獲得Fam114A1 穩(wěn)定過(guò)表達(dá)和抑制的單克隆細(xì)胞株。

2. Fam114A1 對(duì)A375 細(xì)胞黑素合成相關(guān)基因mRNA 及蛋白表達(dá)的影響（圖2）：實(shí)時(shí)熒光定量PCR 結(jié)果顯示，3 組間TYR 和MITF mRNA 相對(duì)表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F = 43.052、39.460，P =0.000 3、0.000 4），而TYRP?1、PMEL、DCT mRNA 相對(duì)表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=3.005、2.535、0.886，P = 0.125、0.159、0.460）。表達(dá)抑制組TYR 和MITF mRNA 相對(duì)表達(dá)顯著低于對(duì)照組（t=7.014、6.672，P<0.001、=0.001），而過(guò)表達(dá)組與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.164、1.843，P=0.140、0.112）。見(jiàn)圖2A。

Western 印跡結(jié)果顯示，3 組間TYR 和MITF 蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=22.750、13.389，P=0.002、0.006），其中，表達(dá)抑制組顯著低于對(duì)照組（t=4.421、4.269，P=0.004、0.005），而過(guò)表達(dá)組與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = 2.243、0.581，P=0.069、0.584）。見(jiàn)圖2B、2C。

3. Fam114A1 對(duì)A375 細(xì)胞增殖活性的影響：MTT 法顯示，培養(yǎng)48 h 后表達(dá)抑制組A375 細(xì)胞增殖活性顯著高于對(duì)照組（t=3.812，P=0.009），但過(guò)表達(dá)組與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.541，P=0.572）。見(jiàn)表2。

4. Fam114A1 對(duì)A375 細(xì)胞遷移能力的影響：Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)顯示，過(guò)表達(dá)組遷移細(xì)胞數(shù)量顯著多于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.110，P=0.021），而表達(dá)抑制組明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.242，P=0.005）。見(jiàn)圖3、表2。

5. Fam114A1 對(duì)A375 細(xì)胞黏附能力的影響：MTT 法顯示，表達(dá)抑制組細(xì)胞黏附能力高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.373，P=0.001），而過(guò)表達(dá)組與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.814，P=0.504）。見(jiàn)表2。

討論

Fam114A1 基因位于人類(lèi)第4 號(hào)染色體，包含14 個(gè)外顯子，編碼的蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。研究［1］顯示，F(xiàn)am114A1蛋白在小鼠大腦、脊髓等神經(jīng)系統(tǒng)中高表達(dá)，并在小鼠胚胎發(fā)育的不同階段差異表達(dá)，提示Fam114A1 可能與神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育密切相關(guān)。黑素細(xì)胞與神經(jīng)細(xì)胞共同起源于胚胎外胚層的神經(jīng)嵴，而毛囊隆突區(qū)的神經(jīng)嵴干細(xì)胞除了可以分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，還可分化為黑素細(xì)胞［5］。Fam114A1是否參與黑素細(xì)胞的發(fā)育及功能調(diào)控，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。

細(xì)胞增殖活性（A值）0.706±0.035 0.917±0.110a 0.738±0.026 8.904 0.016遷移細(xì)胞數(shù)（個(gè)）267.000±30.200 185.700±11.400a 326.700±24.700b 27.313 0.001組別對(duì)照組表達(dá)抑制組過(guò)表達(dá)組F值P值細(xì)胞黏附能力（A值）0.524±0.035 0.733±0.045a 0.545±0.026 22.670 0.002

為研究Fam114A1 對(duì)黑素細(xì)胞生物學(xué)功能的影響，我們構(gòu)建了穩(wěn)定過(guò)表達(dá)及抑制Fam114A1 的A375單克隆細(xì)胞株。進(jìn)一步細(xì)胞生物學(xué)功能研究顯示，抑制Fam114A1表達(dá)可顯著下調(diào)A375細(xì)胞中黑素合成相關(guān)蛋白TYR 和MITF 的表達(dá)。TYR 和MITF 是調(diào)控黑素合成的關(guān)鍵基因。MITF 可調(diào)節(jié)神經(jīng)嵴細(xì)胞的定向分化和細(xì)胞周期進(jìn)展，參與黑素細(xì)胞增殖及黑素化，調(diào)控色素合成限速酶相關(guān)基因TYR、TYRP?1 等表達(dá)，是黑素細(xì)胞生長(zhǎng)存活、黑素生成的主要調(diào)節(jié)者［6］。MITF 和TYR 表達(dá)的下降，會(huì)引起黑素細(xì)胞黑素合成功能下降，使黑素合成減少，造成皮膚色素脫失［7］。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)am114A1可影響A375細(xì)胞中TYR和MITF蛋白的表達(dá)，提示其可能影響黑素細(xì)胞的生物學(xué)功能，參與調(diào)控黑素合成。

此外，我們還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)am114A1蛋白表達(dá)的抑制可一定程度刺激A375 細(xì)胞的生長(zhǎng)，增強(qiáng)其黏附能力，降低其遷移能力。當(dāng)Fam114A1 蛋白過(guò)表達(dá)時(shí)，A375細(xì)胞的遷移能力顯著增強(qiáng)，但對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和黏附能力無(wú)顯著影響，這可能與A375 細(xì)胞本身的高增殖率和黏附能力有關(guān)。因此，有必要進(jìn)一步用正常的黑素細(xì)胞驗(yàn)證Fam114A1 蛋白對(duì)其生長(zhǎng)、黏附方面的影響。

綜上所述，F(xiàn)am114A1 蛋白對(duì)黑素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375 的生物學(xué)功能有多方面的影響，如黑素合成和遷移能力，F(xiàn)am114A1 可能是一種參與調(diào)控黑素細(xì)胞生物學(xué)活性的功能蛋白。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突