黃紅梅 胡宗祥 劉昭強(qiáng) 薄海 彭朋

1 集美大學(xué)體育學(xué)院（福建廈門(mén)361021）

2 中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)后勤學(xué)院衛(wèi)生勤務(wù)系（天津300309）

高血壓患者由于血壓升高（壓力超負(fù)荷）激活神經(jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)，造成心肌細(xì)胞、非心肌細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）基因表達(dá)發(fā)生改變，使心臟結(jié)構(gòu)、代謝與功能經(jīng)歷長(zhǎng)期的模式改建過(guò)程，稱(chēng)為心臟重塑（cardiac remodeling）[1]。心肌ECM 在心臟生長(zhǎng)發(fā)育、結(jié)構(gòu)重塑以及功能穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用。心肌ECM主要成分是膠原（Ⅰ型為主，占80%以上），由成纖維細(xì)胞產(chǎn)生，膠原合成與降解動(dòng)態(tài)平衡對(duì)于維持心臟正常結(jié)構(gòu)與功能具有重要調(diào)節(jié)效應(yīng)。高血壓患者由于長(zhǎng)期血壓升高造成心肌膠原代謝紊亂甚至發(fā)生心肌纖維化、心肌細(xì)胞凋亡，最終引發(fā)心臟結(jié)構(gòu)與功能異常甚至心力衰竭（心衰），說(shuō)明ECM穩(wěn)態(tài)失衡是高血壓心臟重塑及病情進(jìn)展的原因之一[2]?；|(zhì)金屬蛋白酶（ma?trix metalloproteinases，MMPs）是一類(lèi)鋅依賴(lài)性蛋白水解酶家族，催化ECM 蛋白降解，其中MMP-2 是最重要的一種MMPs，在多數(shù)細(xì)胞呈現(xiàn)組成型表達(dá)，其作用是降解變性膠原及其他ECM蛋白。MMPs受組織金屬蛋白酶抑制物（tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMPs）的負(fù)反饋性調(diào)節(jié)，以防止ECM過(guò)度降解。可見(jiàn)MMPs/TIMPs 穩(wěn)態(tài)平衡對(duì)于維持膠原正常代謝至關(guān)重要[2]。此外，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth fac?tor-β1，TGF-β1）介導(dǎo)的信號(hào)通路是多種疾病導(dǎo)致心肌纖維化的共同途徑，可通過(guò)促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞向成肌纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化以及上調(diào)結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（con?nective tissue growth factor，CTGF）等細(xì)胞因子表達(dá)，誘導(dǎo)纖維細(xì)胞增殖，進(jìn)而促進(jìn)心肌纖維化[3]。因此，MMPs/TIMPs 和TGF-β1分別是介導(dǎo)膠原降解與合成的主要調(diào)控因子。研究發(fā)現(xiàn)[2]，MMPs/TIMPs穩(wěn)態(tài)失衡（降解減少）以及TGF-β1持續(xù)激活（合成增加）是高血壓心肌纖維化的主要分子機(jī)制。

積極改變生活方式是高血壓管理的有效手段，其中規(guī)律體力活動(dòng)是健康生活方式的重要方面。研究顯示[4]，中等強(qiáng)度持續(xù)訓(xùn)練（moderate intensity continu?ous training，MICT）是高血壓患者臨床康復(fù)的主要方式，能夠顯著改善患者心肺適能，降低血壓水平，下調(diào)多種心血管危險(xiǎn)因素，提高生活質(zhì)量并降低住院率與死亡率。他人[5]以及本課題組[6-9]前期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，MICT還可減輕高血壓大鼠心肌纖維化，促進(jìn)心肌細(xì)胞再生，從而抑制病理性心臟重塑。因此，MICT 已成為多種慢性非傳染性疾病（包括但不限于心衰、高血壓、糖尿病、肥胖等）患者一級(jí)和二級(jí)預(yù)防的重要策略[4]。然而針對(duì)高血壓患者的最佳運(yùn)動(dòng)康復(fù)處方仍未確定。

流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)[10]，心肺適能是心血管疾病患者全因死亡率的強(qiáng)預(yù)測(cè)因子，也是評(píng)估臨床與康復(fù)治療效果及預(yù)后的重要指征。提升心肺適能包括兩種訓(xùn)練模式，即傳統(tǒng)MICT和近些年來(lái)新興的高強(qiáng)度間歇訓(xùn)練（high intensity interval training，HIIT）。據(jù)報(bào)道，3次/周、共2 周的HIIT 即可改善健康無(wú)訓(xùn)練經(jīng)歷者[11]、2型糖尿病患者[12]和運(yùn)動(dòng)員[13]的運(yùn)動(dòng)能力，與MICT 產(chǎn)生類(lèi)似的效應(yīng)。然而，針對(duì)競(jìng)技運(yùn)動(dòng)員[14]以及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[15，16]的研究顯示，長(zhǎng)期大強(qiáng)度耐力訓(xùn)練導(dǎo)致心肌損傷甚至發(fā)生纖維化，誘發(fā)心血管不良事件。由于HIIT 同樣屬于大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)，故推測(cè)長(zhǎng)期HIIT 同樣可造成心肌適應(yīng)不良。Holloway等[17]研究發(fā)現(xiàn)，高鹽飲食誘導(dǎo)的高血壓大鼠進(jìn)行4 周HIIT 后心臟重塑加重，心肌纖維化未得到改善；而有研究則證實(shí)，4周HIIT通過(guò)改善心肌線(xiàn)粒體穩(wěn)態(tài)，抑制心肌梗塞（心梗）后心衰大鼠的心臟重塑[18，19]，8 周HIIT 減輕自發(fā)性高血壓大鼠（spontane?ously hypertensive rats，SHR）心肌膠原過(guò)度沉積并延緩心衰進(jìn)程[9]。因此，HIIT對(duì)心臟（尤其是病理狀態(tài)下）的作用尚存在爭(zhēng)議。鑒于此，本研究將運(yùn)動(dòng)干預(yù)時(shí)間由前期的8 周[9]延長(zhǎng)至18 周（相當(dāng)于人類(lèi)運(yùn)動(dòng)10年），旨在對(duì)比MICT和HIIT對(duì)SHR心肌膠原代謝和心臟重塑的影響，并探討TGF-β1信號(hào)通路和MMP-2/TIMP-2穩(wěn)態(tài)平衡在其間的作用機(jī)制，探討不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)病理狀態(tài)下心臟的長(zhǎng)期效應(yīng)以及劑量-反應(yīng)關(guān)系，為制定針對(duì)高血壓患者的最佳運(yùn)動(dòng)康復(fù)處方提供循證依據(jù)和干預(yù)靶點(diǎn)，并為其它心血管系統(tǒng)疾病的研究、預(yù)防提供有益借鑒。

1 研究對(duì)象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

45只3月齡雄性SHR，體質(zhì)量220±18 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2018-0027。同時(shí)以15 只同齡、同性別Wistar-Kyoto大鼠作為正常血壓組（WKY）。大鼠飼養(yǎng)環(huán)境：溫度20～22℃，濕度50%～60%，12∶12 h 明暗周期，分籠飼養(yǎng)（3只/籠），自由進(jìn)食水。動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境1周后利用隨機(jī)數(shù)字表法將SHR 分為安靜對(duì)照組（SHR-untrain?ing，SHR-UT 組，n＝15）、MICT 組（SHR-MT 組，n＝15）和HIIT組（SHR-HT組，n＝15），其中SHR-MT和SHRHT 組動(dòng)物分別進(jìn)行18 周MICT 或HIIT，SHR-UT 和WKY組則在鼠籠內(nèi)安靜飼養(yǎng)。

1.2 運(yùn)動(dòng)方案

所有動(dòng)物先進(jìn)行5 d跑臺(tái)適應(yīng)性訓(xùn)練，方案為：速度10～15 m/min，坡度0°，時(shí)間：30 min/d。隨后參照本課題組前期建立的方法[9]測(cè)定大鼠運(yùn)動(dòng)能力：起始負(fù)荷5 m/min，坡度0°，每2 min 增加1.5 m/min，直至力竭，記錄最大跑速（maximal velocity，Vmax）。

根據(jù)Hoydal 等[20]建立的大鼠跑速與最大攝氧量關(guān)系以及本課題組前期研究[9]制定18 周跑臺(tái)訓(xùn)練方案（見(jiàn)表1），訓(xùn)練負(fù)荷（包括跑速、時(shí)間、組數(shù)以及頻率）隨時(shí)間逐漸遞增。分別于第4、8、12 和16 周重新測(cè)定Vmax 并及時(shí)調(diào)整訓(xùn)練強(qiáng)度（跑速）。每次訓(xùn)練時(shí)保證兩組總負(fù)荷（運(yùn)動(dòng)時(shí)間×運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度×組數(shù)）基本一致。

1.3 動(dòng)脈血壓以及超聲心電圖檢測(cè)

每周訓(xùn)練前以及末次訓(xùn)練后48 h，采用智能無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)量?jī)x（BP-2010E，日本）測(cè)定尾動(dòng)脈收縮壓（sys?tolic blood pressure，SBP）。末次血壓測(cè)定后稱(chēng)量體質(zhì)量（body mass，BM）（g），用小動(dòng)物超聲影像系統(tǒng)（Visu?alSonicsVevo 3100，加拿大）進(jìn)行超聲心電圖檢測(cè)，參數(shù)包括：左心室壁厚度（left ventricular wall thickness，LVWT）、左心室舒張末期直徑（left ventricular end-di?astolic diameter，LVEDD）、左心室收縮末期直徑（left ventricular end- systolic diameter，LVESD）和左心室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）。

1.4 大鼠取材與指標(biāo)檢測(cè)

超聲心電圖檢測(cè)后斷頭處死動(dòng)物，取出心臟（分離左心室）、腎上腺和胸腺，分別稱(chēng)其質(zhì)量（mg）并計(jì)算心臟質(zhì)量指數(shù)（heart mass index，HMI）（HMI＝心臟質(zhì)量÷BM）、左心室質(zhì)量指數(shù)（left ventricular mass index，LVMI）（LVMI＝左心室質(zhì)量÷BM）、腎上腺質(zhì)量指數(shù)（adrenal mass index，AMI）（AMI＝腎上腺質(zhì)量÷BM）和胸腺質(zhì)量指數(shù)（thymic mass index，TMI）（AMI＝胸腺質(zhì)量÷BM）。將左心室分為兩部分，一部分用于心肌病理組織學(xué)觀(guān)察，另一部分用錫紙包裹迅速轉(zhuǎn)移至－80℃低溫冰箱凍存待測(cè)基因表達(dá)。

表1 SHR-MT和SHR-HT組18周跑臺(tái)訓(xùn)練方案

1.4.1 心肌病理組織學(xué)觀(guān)察

于心臟橫切面取厚度為2 mm 組織，用4%多聚甲醛溶液固定24 h，石蠟包埋并利用病理切片機(jī)（RM2255，德國(guó)）制作5 μm 切片。用Masson 染色膠原纖維，倒置相差顯微鏡（歐林巴斯IX71，日本）下選取10 個(gè)視野，觀(guān)察膠原沉積情況，用圖像分析軟件（Im?age Pro Plus 6.0，美國(guó)）測(cè)量結(jié)締組織面積與所測(cè)視野面積的比值，作為膠原容積分?jǐn)?shù)（collagen volumetric fraction，CVF）。用HE染色心肌細(xì)胞，鏡下觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)并獲取細(xì)胞橫截面積（cross-sectional area，CSA），所用儀器和軟件同Masson染色。

1.4.2 心肌Ⅰ型膠原（type Ⅰcollagen，ColⅠ）含量檢測(cè)

取適量心肌組織于磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）中勻漿，4 ℃、3 000 g 離心20 min，按照試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）說(shuō)明進(jìn)行操作，利用紫外分光光度計(jì)（日立U-3010，日本）以比色法測(cè)定450 nm 波長(zhǎng)處的OD 值，參照標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算心肌ColⅠ含量（單位為：pg/mg蛋白）。

1.4.3 胚胎基因mRNA表達(dá)檢測(cè)

取心肌組織提取總RNA 后逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA，隨后采用RT-PCR（ABI 7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，美國(guó)）測(cè)定胚胎基因mRNA 表達(dá)量，包括心鈉素（atrial natriuretic peptide，ANP）和β-肌球蛋白重鏈（β-myo?sin heavy chain，β-MHC）。引物序列分別如下：ANP：上游：5’-GGG GGT AGG ATT GAC AGG AT-3’，下游：5’-CTC CAG GAG GGT ATT CAC CA-3’；β-MHC：上游：5’-CCT CGC AAT ATC AAG GGA AA-3’，下游：5’-TAC AG GTG CAT CAG CTC CAG-3’；β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）（內(nèi)參基因）：上游：5’-AGA CCT TCA ACA CCC CAG-3’，下游:5’-GGG CAC AGT GTG GGT GAC-3’。反應(yīng)條件：95℃、5 min；94℃、20 s，60℃、20 s，72℃、10 s；共40 個(gè)循環(huán)。以各組與β-actin的比值計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.4.4 心肌蛋白表達(dá)量檢測(cè)

利用Western Blot 法檢測(cè)蛋白表達(dá)量，包括MMP-2（64 kDa 和72 kDa）（Santa cruz 公司，sc-13594，稀釋比1∶2000）、TIMP-2（Santa cruz公司，sc-21735，稀釋比1∶5000）、TGF-β1（Santa cruz公司，sc-65378，稀釋比1∶2000）、CTGF（Abcam公司，ab6992，稀釋比1∶5000）、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）（Abcam公司，ab32575，稀釋比1∶5000），內(nèi)參蛋白為βactin（SANTA CRUZ公司，sc-81760，稀釋比1∶5000）或3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate de?hydrogenase，GAPDH）（Abcam公司，ab181602，稀釋比1∶10000）。心肌組織勻漿后，提取總蛋白，用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度。取100 μg 蛋白樣品在垂直電泳儀上經(jīng)7.5% SDS-PAGE 分離后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜。兔抗鼠一抗4℃靜置孵育過(guò)夜，二抗（辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG，武漢博士德生物工程有限公司，AR1017，稀釋比1∶2000）37℃孵育2 h。充分洗滌后，ECL 發(fā)光成像，利用凝膠成像系統(tǒng)（ChemiDoc XRS，美國(guó)）拍攝并掃描各條帶灰度值。將各組與β-actin 或GAPDH灰度值的比值作為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。SBP 隨時(shí)間的變化采用重復(fù)測(cè)量方差分析，其他各參數(shù)組間比較使用單因素方差分析，若F檢驗(yàn)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，則多重比較采用Newman-Keuls檢驗(yàn)。顯著性水平定為α＝0.05。統(tǒng)計(jì)軟件使用SPSS 20.0 for Windows。

2 結(jié)果

2.1 樣本量分析

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，由于拒跑、意外死亡等原因，共剔除8只大鼠，因此最終樣本量n＝52，其中WKY組（n＝15）、SHR-C 組（n＝14）、SHR-MT 組（n＝11）和SHRHT組（n＝12）。

2.2 SBP的動(dòng)態(tài)變化

SBP 的動(dòng)態(tài)時(shí)程變化見(jiàn)圖1。WYK 組各時(shí)間點(diǎn)SBP 均低于其他3 組（P＜0.05）；SHR-MT 和SHR-HT 組SBP于第4周時(shí)開(kāi)始下降（P＜0.05），隨后SHR-MT組下降趨勢(shì)一直持續(xù)至訓(xùn)練結(jié)束后（P＜0.05），而SHR-HT組則呈現(xiàn)雙相變化特征，即第4～9 周下降（P＜0.05），第10 周開(kāi)始升高并于第15 周與SHR-UT 組無(wú)顯著性差異（P＞0.05），其中第13～18 周高于SHR-MT 組（P＜0.05）。

圖1 SBP的動(dòng)態(tài)變化

2.3 體重以及各組織質(zhì)量的變化

體重以及各組織（心臟、腎上腺和胸腺）質(zhì)量的變化見(jiàn)表2。與WKY組比較，SHR-UT組BM和TMI下降（P＜0.05），HMI、LVMI 和AMI 升高（P＜0.05）。與SHRUT 組比較，SHR-MT 組AMI 下降（P＜0.05），TMI 升高（P＜0.05）；SHR-HT 組HMI、LVMI 和AMI 增加（P＜0.05），TMI 降低（P＜0.05）。與SHR-MT 組比較，SHRHT 組HMI、LVMI 和AMI 增加（P＜0.05），TMI 降低（P＜0.05）。

表2 體重以及心臟、腎上腺和胸腺質(zhì)量的變化

2.4 心臟結(jié)構(gòu)與功能的變化

超聲心動(dòng)圖結(jié)果見(jiàn)圖2，心臟結(jié)構(gòu)與功能的變化見(jiàn)表3。與WKY 組比較，SHR-UT 組LVEDD、LVESD 和LVEF 下降（P＜0.05），LVWT 升高（P＜0.05）。與SHRUT 組 比 較，SHR-MT 組LVEDD、LVESD、LVWT 和LVEF 升高（P＜0.05）；SHR-HT 組LVEDD 和LVESD 升高（P＜0.05），LVWT 和LVEF 下降（P＜0.05）。與SHRMT 組比較，SHR-HT 組LVEDD 升高（P＜0.05），LVWT和LVEF降低（P＜0.05）。

圖2 超聲心動(dòng)圖

表3 心臟結(jié)構(gòu)與功能的變化

2.5 心肌病理組織學(xué)觀(guān)察

心肌Masson 染色結(jié)果見(jiàn)圖3，心臟CVF 的變化見(jiàn)圖4，ColⅠ含量的變化見(jiàn)圖5。Masson 染色結(jié)果顯示，心肌細(xì)胞呈紅色，膠原纖維呈藍(lán)色。WKY組心肌肌束間有極少量膠原纖維；SHR-UT 和SHR-HT 組心肌間質(zhì)可見(jiàn)明顯纖維化改變及膠原沉積，CVF和ColⅠ含量均較WKY 組顯著升高（P＜0.05）；與SHR-UT 組比較，SHR-MT 組纖維化程度明顯減輕，CVF 和ColⅠ含量下降（P＜0.05），SHR-HT組膠原沉積加重且CVF、ColⅠ含量進(jìn)一步升高（P＜0.05）。

心肌HE 染色結(jié)果見(jiàn)圖6，心肌細(xì)胞CSA 的變化見(jiàn)圖7。HE染色結(jié)果顯示，心肌細(xì)胞胞漿染成粉紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)色。WKY 組心肌細(xì)胞排列規(guī)整，SHR-UT 和SHR-HT 組細(xì)胞排列紊亂，體積增大，CSA 高于WKY組（P＜0.05）；SHR-MT 組心肌細(xì)胞排列較SHR-UT 和SHR-HT 組規(guī)整，但心肌細(xì)胞肥大并未減輕，CSA 仍高于WKY組（P＜0.05）。

圖3 心肌Masson染色（×400）

圖4 心臟CVF的變化

圖5 心臟ColⅠ含量的變化

圖6 心肌HE染色（×400）

圖7 心肌細(xì)胞CSA的變化

2.6 心肌胚胎基因表達(dá)的變化

心肌胚胎基因表達(dá)的變化見(jiàn)圖8。與WKY 組比較，SHR-UT和SHR-HT組ANP和β-MHC mRNA表達(dá)量上調(diào)（P＜0.05）；與SHR-UT 組比較，SHR-MT 組ANP和β-MHC mRNA 表達(dá)量下調(diào)（P＜0.05），SHR-HT 組表達(dá)量則上調(diào)（P＜0.05）；與SHR-MT 組比較，SHR-HT 組胚胎基因表達(dá)量上調(diào)（P＜0.05）。

圖8 心肌胚胎基因表達(dá)的變化

2.7 心肌MMP-2和TIMP-2蛋白表達(dá)量的變化

心肌MMP-2 蛋白表達(dá)量的變化見(jiàn)圖9。與WKY組比較，SHR-UT 和SHR-HT 組64 kDa MMP-2 蛋白表達(dá)量下調(diào)（P＜0.05）；與SHR-UT 組比較，SHR-MT 組64 kDa MMP-2蛋白表達(dá)量上調(diào)（P＜0.05），SHR-HT組則無(wú)顯著性變化（P＜0.05）；與SHR-MT 組比較，SHRHT 組64 kDa MMP-2 蛋白表達(dá)量下調(diào)（P＜0.05）。各組72 kDa MMP-2 蛋白表達(dá)量均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

心肌TIMP-2蛋白表達(dá)量的變化見(jiàn)圖10。與WKY組比較，SHR-UT 和SHR-MT 組TIMP-2蛋白表達(dá)量下調(diào)（P＜0.05）；與SHR-UT組比較，SHR-MT組TIMP-2蛋白表達(dá)量無(wú)顯著性變化（P＞0.05），SHR-HT 組則上調(diào)（P＜0.05）；與SHR-MT 組比較，SHR-HT 組TIMP-2 蛋白表達(dá)量上調(diào)（P＜0.05）。

64 kDa MMP-2/TIMP-2 比值的變化見(jiàn)圖11。與WKY 組比較，SHR-UT 和SHR-HT 組64 kDa MMP-2/TIMP-2比值下降（P＜0.05），SHR-MT組升高（P＜0.05）；與SHR-UT 組 比 較，SHR-MT 組64 kDa MMP-2/TIMP-2 比值增加（P＜0.05），SHR-HT 組則降低（P＜0.05）；與SHR-MT 組比較，SHR-HT 組64 kDa MMP-2/TIMP-2比值下降（P＜0.05）。

圖9 心肌MMP-2蛋白表達(dá)量的變化

圖10 心肌TIMP-2蛋白表達(dá)量的變化

圖11 64 kDa MMP-2/TIMP-2比值的變化

2.8 心肌TGF-β1、CTGF和α-SMA蛋白表達(dá)量的變化

心肌TGF-β1、CTGF 和α-SMA 蛋白表達(dá)量的變化依次見(jiàn)圖12、圖13和圖14。與WKY組比較，SHR-UT、SHR-MT和SHR-HT組TGF-β1、CTGF以及SHR-UT和SHR-HT 組α-SMA 蛋白表達(dá)量上調(diào)（P＜0.05），SHRMT 組α-SMA 表達(dá)量無(wú)顯著性變化（P＞0.05）；與SHRUT 組比較，SHR-MT 組TGF-β1、CTGF 和α-SMA 蛋白表達(dá)量下調(diào)（P＜0.05），SHR-HT組則無(wú)顯著性變化（P＞0.05）；與SHR-MT 組比較，SHR-HT 組TGF-β1、CTGF和α-SMA蛋白表達(dá)量升高（P＜0.05）。

圖12 心肌TGF-β1蛋白表達(dá)量的變化

圖13 心肌CTGF蛋白表達(dá)量的變化

圖14 心肌α-SMA蛋白表達(dá)量的變化

3 討論

3.1 主要發(fā)現(xiàn)

本研究旨在探討長(zhǎng)期（18周，相當(dāng)于人類(lèi)10年）不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)SHR 心肌纖維化的影響及機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：MICT 后心肌膠原含量和α-SMA表達(dá)降低，TGF-β1介導(dǎo)的信號(hào)途徑受到抑制，MMP-2/TIMP-2 平衡得到改善，心臟發(fā)生生理性肥大的同時(shí)，胚胎基因表達(dá)下調(diào)，心功能提高，說(shuō)明MICT通過(guò)降低膠原合成、促進(jìn)膠原降解并抑制成纖維細(xì)胞向成肌纖維細(xì)胞分化，改善心肌纖維化，進(jìn)而延緩S(chǎng)HR 心臟重塑和心衰進(jìn)程。然而HIIT 后膠原含量進(jìn)一步增加，MMP-2/TIMP-2 穩(wěn)態(tài)失衡，但TGF-β1信號(hào)通路和α-SMA表達(dá)并無(wú)顯著性變化，心臟病理性肥大加劇，胚胎基因表達(dá)上調(diào)，心功能下降，提示HIIT通過(guò)抑制膠原降解（但對(duì)膠原合成無(wú)顯著影響）加重心肌纖維化（反應(yīng)性心肌纖維化），繼而加速SHR 心臟重塑和心衰進(jìn)程。因此，長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)高血壓患者的心臟健康效應(yīng)具有訓(xùn)練強(qiáng)度依賴(lài)性。

3.2 不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)SHR 心臟結(jié)構(gòu)、功能以及心肌纖維化的影響

心臟肥大是高血壓時(shí)應(yīng)對(duì)過(guò)高室壁應(yīng)力的代償反應(yīng)，在本研究中，與WKY 組比較，SHR-UT 組HMI、LV?MI 以及心肌細(xì)胞CSA 升高，超聲檢查發(fā)現(xiàn)LVEDD 和LVESD下降、LVWT增加，提示心臟表型發(fā)生向心性肥大（心肌肥大伴心腔縮窄）。伴隨心臟代償能力下降，心功能（LVEF）降低并逐步轉(zhuǎn)向心衰，ANP 和β-MHC mRNA 表達(dá)量上調(diào)亦證實(shí)了這一點(diǎn)（胚胎基因過(guò)表達(dá)是心衰進(jìn)展與預(yù)后的重要標(biāo)志物[21]）。因此，高血壓誘導(dǎo)的心臟肥大屬于病理性心臟肥大，其原因是心肌細(xì)胞體積增大和膠原沉積增加共同作用所致。經(jīng)過(guò)18周MICT 后，SHR-MT 組HMI、LVMI 以及心肌細(xì)胞CSA與SHR-UT組并無(wú)顯著性差異，似乎說(shuō)明MICT并未改善高血壓性心臟肥大。然而超聲檢測(cè)進(jìn)一步顯示，LVEDD、LVESD和LVWT升高，提示心臟發(fā)生離心性肥大。由于心功能（LVEF）提高，因此，運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)SHR 心臟由病理性肥大向生理性肥大轉(zhuǎn)變，同時(shí)心衰進(jìn)程得以延緩（胚胎基因表達(dá)下調(diào)）。這與本課題組前期研究[9]、Garciarena 等[22]讓SHR進(jìn)行持續(xù)游泳耐力訓(xùn)練、施曼莉等[23]讓心梗后心衰大鼠進(jìn)行中等強(qiáng)度持續(xù)跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)以及針對(duì)耐力項(xiàng)目運(yùn)動(dòng)員流行病學(xué)調(diào)查[24]的結(jié)果一致。出乎意料的是，SHR-HT 組雖然在表型上同樣發(fā)生離心性肥大（HMI、LVMI、LVEDD和LVESD增加），但心腔擴(kuò)張同時(shí)室壁變?。↙VWT 下降），這一改變將導(dǎo)致室壁應(yīng)力大幅增加，加之胚胎基因進(jìn)一步上調(diào)，提示HIIT 加重病理性心臟肥大并加速心衰進(jìn)程，這與本課題組前期[16]采用長(zhǎng)期隨意轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)的研究結(jié)果類(lèi)似。此外，由于SHR-HT 組CSA 并無(wú)顯著性變化而CVF 和Col-I含量升高，因此HIIT誘導(dǎo)的心臟肥大主要與膠原過(guò)度沉積有關(guān)。

心肌纖維化是高血壓患者最常見(jiàn)的并發(fā)癥，導(dǎo)致心臟硬度增加以及心室壁順應(yīng)性下降，進(jìn)而影響心臟舒縮功能[25]，增加心肌電不均一性（heterogeneity），易引發(fā)室性心律失常，是心血管疾病患者心源性猝死的重要原因[2]。在本研究中，SHR-UT 組較WKY 組心肌ColⅠ含量增加，Masson染色結(jié)果顯示心肌CVF升高，提示伴隨高血壓進(jìn)展，心臟膠原過(guò)度沉積并最終引起心肌纖維化。調(diào)控ECM 穩(wěn)態(tài)是抑制心臟病理性重塑、防治諸多心血管疾病的重要策略。經(jīng)過(guò)18周運(yùn)動(dòng)后，SHRMT 組CVF 和ColⅠ含量較SHR-UT 組明顯下降，但仍高于WKY 組，提示長(zhǎng)期MICT 能夠延緩S(chǎng)HR 心肌纖維化，與課題組前期研究結(jié)果一致[6，8，9]。膠原減少有利于恢復(fù)心動(dòng)周期過(guò)程中異常的心肌收縮力分布以及提高心室壁順應(yīng)性[26]，進(jìn)而增強(qiáng)心臟舒縮功能。此外，Choi等[27]的研究還發(fā)現(xiàn)，有氧運(yùn)動(dòng)可通過(guò)減少心肌膠原交聯(lián)，改善增齡引起的心臟舒張障礙。因此，我們推測(cè)，MICT對(duì)膠原網(wǎng)絡(luò)的生化組成和空間結(jié)構(gòu)均具有積極作用。HIIT 對(duì)心肌纖維化的影響鮮有關(guān)注，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，8 周HIIT 減輕SHR 心肌纖維化；而Holloway 等[17]則證實(shí)，4周HIIT未改善高鹽飲食誘導(dǎo)的高血壓大鼠心肌膠原沉積，可能與動(dòng)物模型不同以及干預(yù)時(shí)間較短有關(guān)。然而令人意外的是，本研究將干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)至18周后，SHR-HT組CVF和ColⅠ含量較SHR-UT 組進(jìn)一步增加，說(shuō)明長(zhǎng)期HIIT 加重左室纖維化。研究顯示，長(zhǎng)期高強(qiáng)度劇烈運(yùn)動(dòng)同樣可導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)員[14]或健康大鼠[15]發(fā)生心肌纖維化，但主要存在于心房和右心室，提示健康與疾病狀態(tài)下過(guò)度運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的心肌纖維化可能存在部位特異性。由于本研究?jī)H對(duì)左心室進(jìn)行取材，因此HIIT 對(duì)其他心臟部位膠原沉積的影響尚未明確。

心肌纖維化表型按照有無(wú)細(xì)胞壞死和瘢痕形成分為反應(yīng)性、浸潤(rùn)性和替代性三種類(lèi)型[28]。浸潤(rùn)性和替代性心肌纖維化存在炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、細(xì)胞壞死甚至瘢痕形成，同時(shí)伴隨成纖維細(xì)胞（fibroblast）向成肌纖維細(xì)胞（myofibroblast）轉(zhuǎn)化，后者膠原蛋白合成和分泌能力明顯增加，且具有較強(qiáng)的遷移和促纖維化作用[28]。α-SMA 是成肌纖維細(xì)胞標(biāo)志物，其表達(dá)量是診斷心肌纖維化類(lèi)型的重要參考標(biāo)準(zhǔn)[29]。在本研究中，SHR-UT組α-SMA表達(dá)量顯著上調(diào)，提示SHR發(fā)生浸潤(rùn)性或替代性心肌纖維化；18 周運(yùn)動(dòng)后，SHR-MT 組α-SMA 蛋白表達(dá)量下調(diào)，說(shuō)明MICT在改善心肌纖維化的同時(shí)還能夠抑制成纖維細(xì)胞向成肌纖維細(xì)胞分化。值得注意的是，SHR-HT 組雖然CVF 和ColⅠ含量較SHR-UT 組升高，但α-SMA蛋白表達(dá)量并未進(jìn)一步上調(diào)，提示高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的心肌纖維化類(lèi)型屬反應(yīng)性心肌纖維化。Aschar等[30]同樣發(fā)現(xiàn)，健康小鼠6周高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后成纖維細(xì)胞數(shù)量明顯升高，而成肌纖維細(xì)胞并未增加。Benito等[15]證實(shí)，長(zhǎng)期劇烈運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的大鼠心肌纖維化在停訓(xùn)8 周后即得到完全逆轉(zhuǎn)，說(shuō)明運(yùn)動(dòng)性心肌纖維化具有可逆性特征。由此推斷，SHR-HT 組大鼠若及時(shí)停訓(xùn)或?qū)⑦\(yùn)動(dòng)強(qiáng)度降低，其心肌纖維化程度將得以緩解。由于反應(yīng)性心肌纖維化僅ECM 異常增多，無(wú)細(xì)胞壞死或瘢痕形成，且可通過(guò)一定干預(yù)手段改善和逆轉(zhuǎn)[28]，因此，在訓(xùn)練期間監(jiān)測(cè)α-SMA的變化對(duì)于評(píng)價(jià)干預(yù)效果并及時(shí)調(diào)整干預(yù)策略具有指導(dǎo)意義。

3.3 不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)SHR心肌纖維化信號(hào)通路的影響

高血壓時(shí)發(fā)生心肌纖維化的具體機(jī)制尚未完全明確，可能與MMP-2/TIMP-2 穩(wěn)態(tài)平衡（司膠原降解）以及TGF-β1信號(hào)途徑（司膠原合成）異常有關(guān)[2]。MMP-2合成初始是以無(wú)活性的酶原（酶前體）形式存在（72 kDa MMP-2），隨后通過(guò)翻譯后調(diào)控而活化（64 kDa MMP-2）[31]；TIMP-2 可與MMP-2 形成穩(wěn)定復(fù)合物，阻礙酶原活化或抑制已活化的酶活性。在本研究中，與WKY 組比較，SHR-UT 組72 kDa MMP-2 蛋白表達(dá)量并無(wú)顯著性差異，而64 kDa MMP-2降低，說(shuō)明高血壓對(duì)MMP-2酶原并無(wú)影響，但顯著抑制MMP-2活性，這與黃偉等[32]以衰老大鼠為模型的研究結(jié)果類(lèi)似。本研究還發(fā)現(xiàn)，SHR-UT 組TIMP-2 蛋白表達(dá)量較WKY 組下降，似乎暗示TIMP-2 對(duì)MMP-2 的抑制效應(yīng)減弱。Yang等[33]的研究結(jié)果進(jìn)一步顯示，MMPs與TIMPs之間的動(dòng)態(tài)平衡（用兩者的比值表示）是膠原代謝的決定因素。本研究中SHR-UT 組64 kDa MMP-2/TIMP-2 比值較WKY組下降，說(shuō)明MMP-2活性受到TIMP-2的抑制，其降解膠原的作用降低。此外，SHR-UT組TGF-β1和CTCF 蛋白表達(dá)量升高，因此，SHR 心肌纖維化是TGF-β1過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)膠原合成增加以及MMP-2/TIMP-2穩(wěn)態(tài)失衡造成膠原降解減少共同作用所致。

經(jīng)過(guò)18 周MICT，與SHR-UT 組比較，SHR-MT 組64 kDa MMP-2明顯升高，而TIMP-2表達(dá)量無(wú)顯著性變化，故64 kDa MMP-2/TIMP-2 比值增加，提示TIMP-2 對(duì)MMP-2 的抑制作用得到解除，MMP-2/TIMP-2 穩(wěn)態(tài)失衡改善，膠原降解增加，這與Kwak 等[34]的研究結(jié)果一致，即12 周跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)上調(diào)衰老大鼠MMP-2 活性。在甄潔等[35]的研究中，心梗后心衰大鼠進(jìn)行10周跑臺(tái)訓(xùn)練后雖然MMP-1和TIMP-1蛋白表達(dá)量均顯著下降，但MMP-1/TIMP-1比值增加，與本研究結(jié)果類(lèi)似。與此同時(shí)，SHR-MT 組TGF-β1和CTGF 表達(dá)量較SHR-UT組下調(diào)，提示MICT通過(guò)增加膠原降解并抑制其合成而改善SHR心肌纖維化。在Rossoni等[5]的研究中，老年SHR進(jìn)行13周低強(qiáng)度（50%Vmax）跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)后心臟CVF 下降、MMP-2 活性增加，而TGF-β1和CTGF表達(dá)量并無(wú)顯著性變化，由此認(rèn)為運(yùn)動(dòng)對(duì)膠原合成并無(wú)影響，心肌纖維化減輕主要是膠原降解增加所致。動(dòng)物年齡（老年vs.青年）、干預(yù)時(shí)間（13周vs.18周）以及運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度（低強(qiáng)度vs.中等強(qiáng)度）等可能是不同研究結(jié)果存在差異的主要原因。然而18 周HIIT 后，與SHR-UT 組比較，SHR-HT 組64 kD MMP-2 無(wú)顯著性變化而TIMP-2 顯著升高，64 kDa MMP-2/TIMP-2 比值下降，說(shuō)明TIMP-2 對(duì)MMP-2 的抑制作用增強(qiáng)，MMP-2/TIMP-2 系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)平衡進(jìn)一步破壞，膠原降解減少。然而TGF-β1和CTGF表達(dá)量與SHR-UT組并無(wú)顯著性差異，提示長(zhǎng)期HIIT 通過(guò)抑制膠原降解而加重心肌纖維化，但對(duì)膠原合成無(wú)明顯影響。該結(jié)果與Benito 等[15]的研究不同，他們發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期大強(qiáng)度持續(xù)跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)健康大鼠發(fā)生心肌纖維化，同時(shí)伴T(mén)GF-β1表達(dá)上調(diào)，可能與動(dòng)物模型、運(yùn)動(dòng)方式和運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度等因素有關(guān)。

3.4 對(duì)HIIT心臟效應(yīng)的可能解釋

值得注意的是，本課題組前期研究結(jié)果顯示，4 周HIIT抑制心梗后心衰大鼠心臟重塑[18，19]，8周HIIT減輕SHR 心肌膠原沉積[9]，但我們將干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)至18 周后卻發(fā)現(xiàn)心肌纖維化程度與心臟重塑加劇。Holloway等的研究[17]證實(shí)，4周HIIT加速高鹽飲食誘導(dǎo)的高血壓大鼠心衰進(jìn)程。王增喜等[36]的研究顯示，6周HIIT可誘導(dǎo)健康大鼠暫時(shí)性病理性心臟肥大及心功能下降，10周時(shí)恢復(fù)。研究結(jié)果存在差異甚至矛盾可能與實(shí)驗(yàn)對(duì)象、造模方式、運(yùn)動(dòng)負(fù)荷以及干預(yù)時(shí)間等因素有關(guān)。結(jié)合本研究結(jié)果，我們認(rèn)為，HIIT對(duì)心臟的作用可能存在一過(guò)性特征。本研究稱(chēng)取腎上腺和胸腺質(zhì)量作為慢性應(yīng)激參數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SHR-HT 組較SHR-UT 組進(jìn)一步發(fā)生腎上腺肥大和胸腺萎縮，因此HIIT 的心臟效應(yīng)可采用應(yīng)激學(xué)說(shuō)來(lái)闡釋[37]。本研究設(shè)計(jì)的訓(xùn)練負(fù)荷隨時(shí)間推移逐漸遞增，前8 周負(fù)荷較低（70%～80%Vmax、10～56 min/d、3～5 d/w），這種適宜的應(yīng)激刺激引起氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡以及物質(zhì)與能量代謝等基本信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路輕度激活，產(chǎn)生的各種細(xì)胞因子亦處于生理水平，進(jìn)而誘導(dǎo)心臟產(chǎn)生良性適應(yīng)。然而隨著運(yùn)動(dòng)負(fù)荷增加（后10 周：90%Vmax、56 min/d、5 d/w），運(yùn)動(dòng)應(yīng)激超過(guò)了機(jī)體的代償能力，加之心臟重塑依然在隱匿中進(jìn)行，上述信號(hào)途徑持續(xù)激活并產(chǎn)生過(guò)量（病理水平）有害因子（如氧自由基、促炎癥因子、促凋亡因子等），因此心臟逐漸發(fā)生適應(yīng)不良。訓(xùn)練期間SHR-HT組SBP的動(dòng)態(tài)變化呈現(xiàn)雙相反應(yīng)特征（先下降后升高）也間接印證了上述推斷。此外，高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)還可經(jīng)由心理應(yīng)激造成腸道菌群紊亂[38]，而后者是高血壓發(fā)生發(fā)展的原因之一[39]，故推測(cè)HIIT 尚能夠通過(guò)誘導(dǎo)腸道菌群失衡加重SHR心臟重塑。

4 結(jié)論

長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)高血壓的心臟健康效應(yīng)具有訓(xùn)練強(qiáng)度依賴(lài)性，其機(jī)制與TGF-β1介導(dǎo)的信號(hào)途徑、MMP-2/TIMP-2穩(wěn)態(tài)平衡對(duì)不同強(qiáng)度訓(xùn)練的適應(yīng)存在差異有關(guān)，其中MICT通過(guò)降低膠原合成并促進(jìn)其降解以及抑制成纖維細(xì)胞向成肌纖維細(xì)胞分化改善心肌纖維化，進(jìn)而延緩S(chǎng)HR心臟重塑和心衰進(jìn)程，而長(zhǎng)期HIIT則通過(guò)抑制膠原降解（但對(duì)膠原合成無(wú)顯著影響）加重心肌纖維化（反應(yīng)性心肌纖維化），繼而加速SHR 心臟重塑和心衰進(jìn)程。因此，目前MICT仍然是高血壓患者運(yùn)動(dòng)康復(fù)的最佳方式，HIIT并非適用于任何人群（心血管疾病患者更應(yīng)持謹(jǐn)慎態(tài)度），其安全性和有效性尚待進(jìn)一步證實(shí)。