李亮亮 由玉巖 金修哲 張 卓 孫樂天衛(wèi)澤珍 楊引亮 劉學(xué)鋒 張成林 李曉光

(1.太原動(dòng)物園，太原，030009；2.圈養(yǎng)野生動(dòng)物技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京，100044)

華北豹(Pantherapardusfontanierii)又稱金錢豹、中國豹，屬于哺乳綱(Mammalia)，食肉目(Carnivora)，貓科(Felidae)，豹屬，大型食肉動(dòng)物，是我國特有的一個(gè)亞種，被列為國家Ⅰ級(jí)重點(diǎn)保護(hù)動(dòng)物。

動(dòng)物體內(nèi)雌激素(主要是雌二醇)變化對(duì)動(dòng)物發(fā)情周期有很重要的調(diào)節(jié)作用，因此測定雌二醇水平對(duì)于該物種的繁殖和保護(hù)具有重要的意義。利用血液樣品來測定華北豹雌二醇的含量是一種不錯(cuò)的方法，但是采血時(shí)需要對(duì)動(dòng)物進(jìn)行麻醉保定，對(duì)動(dòng)物應(yīng)激很大。因此采用非損傷取樣法(noninvasive sampling)，該方法具有采集樣品方便，樣品易于保存，同時(shí)在采樣時(shí)不會(huì)對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生不良的應(yīng)激，且糞便中雌二醇含量反映的是動(dòng)物一段時(shí)間內(nèi)的平均水平，能更加準(zhǔn)確地反映動(dòng)物的生理狀態(tài)和繁殖性能。目前有東北虎(Pantheratigrisaltaica)[1]、獰貓(Caracalcaracal)[2]、川金絲猴(Rhinopithecusroxellanae)[3-4]、滇金絲猴(Rhinopithecusbieti)[5]、麋鹿(Elaphurusdavidianus)[6]、東北梅花鹿(Cervusnipponhortulorum)[7]等動(dòng)物糞樣中激素的提取報(bào)道。但是迄今尚無關(guān)于華北豹糞樣中雌激素提取方法相關(guān)的報(bào)道。為此，本文篩選了甲醇加熱法、乙醇加熱法和乙醇蒸餾水法3種進(jìn)項(xiàng)實(shí)驗(yàn)方法，探討適用于華北豹糞樣中雌激素的理想提取方法。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

2019年3月中旬，在太原動(dòng)物園華北豹館采集的成年雌性華北豹的糞便樣品作為研究對(duì)象。選取1只健康，有繁殖史雌性華北豹作為取樣對(duì)象。

1.2 糞便樣品的采集與保存

前一天把獸舍打掃干凈，第2天8：00—9：00采集華北豹的糞樣，裝入自封袋內(nèi)，做好標(biāo)記，存入-20 ℃冰箱，備用。

1.3 糞便樣品雌二醇的提取

將糞便從-20 ℃冰箱中取出，在室溫條件下進(jìn)行解凍，待糞樣解凍后剔除雜質(zhì)，充分研磨粉碎并混合均勻，備用。

采用以下3種抽提方法進(jìn)行激素的提取。

1.3.1 乙醇加熱法(Ethanol-heating method)

參照Wasser等[8]的方法并進(jìn)行改進(jìn)優(yōu)化。

(1)用電子秤稱取1 g糞便于離心管中，加入80%的乙醇10 mL。

(2)然后在70 ℃振蕩水浴15 min。冷卻至4 ℃，離心(4 000 r/min，15 min)，取上清液至試管中。

(3)殘?jiān)尤? mL 80%乙醇重新懸浮起，渦旋震蕩1 min，離心(3 000 r/min，15 min)。

(4)合并上清液，將含有乙醇的上清液60 ℃水浴空氣吹干。

(5)加1 mL，0.05 mol/L的PBS復(fù)溶，-20 ℃保存，備檢。

1.3.2 甲醇加熱法(Carbinol-heating method)

參照郎冬梅等[9]、李瓊[10]的方法并進(jìn)行改進(jìn)。

(1)用電子秤稱取1 g糞便于離心管中，加入90%的甲醇10 mL。

(2)在渦旋震蕩儀上充分震蕩1 min，置于60 ℃的恒溫水浴鍋中溫浴20 min。

(3)之后在離心機(jī)中以4 000 r/pm離心10 min，取上清液于新的離心管中，置于-20 ℃下保存，備檢。

1.3.3 乙醇蒸餾水法(Ethanol-distilled-water method)

參照高云芳等[11]方法并進(jìn)行改進(jìn)。

(1)用電子秤稱取1 g糞便于離心管中，加入90%的甲醇10 mL。

(2)超聲波振蕩30 min，離心(3 000 r/min，10 min)取3 mL上清液。

(3)再加入2 mL乙醇，超聲波振蕩30 min，離心(3 000 r/min，10 min)。

(4)取3 mL上清液，合并兩次上清液置玻璃瓶中，37 ℃水浴蒸發(fā)干燥。

(5)然后向玻璃瓶中依次緩慢加入3 mL甲醇、1 mL蒸餾水、2 mL乙醚，靜置30 min，此時(shí)溶液分成上下兩層。

(6)從下層中取2 mL溶液，37 ℃水浴蒸發(fā)干燥后，加入0.05 mol/L的PBS緩沖液1 mL，37 ℃水浴振蕩30 min，置于-20 ℃下保存，備檢。

1.4 華北豹糞樣中雌二醇含量的測定

將上述3種方法抽提樣品，每份各取500 μL于10 mL 離心管內(nèi)，用PBS溶液進(jìn)行10倍稀釋確保其檢測結(jié)果處于相應(yīng)試劑盒的允許檢測范圍之內(nèi)，將稀釋后的樣品保存于-20 ℃冰箱，備用。激素的檢測工作委托北京北方生物研究所進(jìn)行完成。每份樣品平行測試6次。所用檢測試劑盒為碘[125I]雌二醇放射免疫分析藥盒試劑盒(批號(hào)：20190420)。相關(guān)試劑盒的詳細(xì)參數(shù)詳見說明書。

1.5 數(shù)據(jù)的分析

采用K-S檢驗(yàn)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布，然后采用單因素重復(fù)測量方差分析(one-way repeat measure ANOVA)，對(duì)具有顯著差異的組合分別進(jìn)行配對(duì)t-檢驗(yàn)(paired-sampletttest)方法，以P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

變異系數(shù)是衡量各組(項(xiàng))觀測值變異程度的統(tǒng)計(jì)量，標(biāo)準(zhǔn)差與平均數(shù)的比值為變異系數(shù)，用C-V來表示，變異系數(shù)小則方法組合的穩(wěn)定性高。公式為：C-V=SD/Mean×100%。

所有統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)通過SPSS 20完成，所有數(shù)據(jù)的特征用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取方法對(duì)圈養(yǎng)華北豹糞便樣品中雌二醇提取含量的對(duì)比

甲醇加熱法測得的含量為(2 815.47±297.47)pg/mL，乙醇加熱法測得的含量為(7 660.25±1 546.11)pg/mL，乙醇蒸餾水法測得的含量為(1 937.83±231.71)pg/mL。其中利用乙醇加熱法提取的雌二醇含量為高。以抽提方法為組內(nèi)因子，對(duì)糞便中雌二醇含量檢測結(jié)果進(jìn)行單因素重復(fù)測量方差分析，結(jié)果表明，甲醇加熱法與乙醇蒸餾水法2種提取方法的測定結(jié)果間無明顯差異，甲醇加熱法和乙醇蒸餾水法與乙醇加熱法測定結(jié)果間差異顯著。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

2.2 不同提取方法對(duì)圈養(yǎng)華北豹糞便樣品中雌二醇提取含量的對(duì)比

變異系數(shù)的大小能夠表征檢測的穩(wěn)定性，變異系數(shù)大則方法組合的穩(wěn)定性差，變異系數(shù)小則方法組合的穩(wěn)定性高。對(duì)于本研究而言，甲醇加熱法(21.02%)和乙醇加熱法(20.18%)的變異系數(shù)接近，說明這兩2方法提取的雌二醇穩(wěn)定性接近，甲醇加熱法(21.02%)和乙醇加熱法(20.18%)的變異系數(shù)小于乙醇蒸餾水法(27.03%)，說明乙醇蒸餾水法提取雌二醇穩(wěn)定性不如另外2種方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 不同方法提取糞樣中雌二醇含量測定結(jié)果(Mean±SD)

表2 不同抽提方法的變異系數(shù)

3 討論

本研究結(jié)果表明，不同的提取對(duì)華北豹糞便中雌二醇的提取效率有顯著差異。甲醇加熱法提取效率低；乙醇蒸餾法穩(wěn)定性明顯偏低且步驟煩瑣，不利于處理大批量的糞樣樣品。乙醇加熱法是經(jīng)典、高效率的雌二醇抽提方法，該方法已經(jīng)在多個(gè)動(dòng)物的糞樣雌二醇的提取中，有理想的應(yīng)用效果[8，12-13]。

化學(xué)免疫分析法是最早用于激素檢測的免疫檢測法，20世紀(jì)50年代，就通過放射免疫技術(shù)在人的糞便中檢測到了雌二醇[14]。隨后，此項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用于家畜牛中，該方法的靈敏度高，結(jié)果穩(wěn)定，若條件允許，可以選用化學(xué)免疫分析法進(jìn)行雌二醇水平檢測。

在本次實(shí)驗(yàn)中，所采集的華北豹的糞便樣品均來自同一只動(dòng)物，采集的動(dòng)物樣本數(shù)量相對(duì)較少。為了保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確可靠，在實(shí)驗(yàn)中增加了樣本的重復(fù)數(shù)(6次)，以此減少誤差，達(dá)到確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確可靠目的。

綜上所述，建議在提取華北豹糞便中雌二醇時(shí)，以乙醇加熱法提取糞便中雌二醇為較理想的一種提取方法。