楊勝濤，陳佳麗，劉 怡，蕭振邦，洪鵬志,3，周春霞,3

異紅藻糖苷對HT1080腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移作用的影響

楊勝濤1，陳佳麗1，劉 怡2，蕭振邦2，洪鵬志1,3，周春霞1,3

（1. 廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院//廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室//廣東省海洋食品工程技術(shù)研究中心，廣東 湛江 524088；2. 廣東海洋大學(xué)化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，廣東 湛江 524088；3. 南方海洋科學(xué)與工程廣東省實驗室（湛江），廣東 湛江 5240225）

【】分析異紅藻糖苷（-Isofloridoside，DIF）對HT1080腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移作用的影響。用MTT法檢測細(xì)胞存活率，細(xì)胞劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移能力，明膠酶譜實驗檢測細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）和基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）的活性，Western blot法檢測低氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）蛋白的表達(dá)情況，ELISA法檢測血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的釋放量，分子對接預(yù)測DIF與MMP-2、MMP-9和HIF-1α蛋白的相互作用。MTT和劃痕實驗表明DIF對HT1080細(xì)胞無明顯毒性作用（> 0.05），且能極顯著降低腫瘤細(xì)胞的體外遷移能力（< 0.01）；與對照組相比，隨著實驗組DIF濃度增加，MMP-2和MMP-9的活性以及HIF-1α和VEGF蛋白的表達(dá)極顯著減少（< 0.01）。分子對接預(yù)測結(jié)果表明，DIF與MMP-2、MMP-9和HIF-1α均能形成穩(wěn)定的氫鍵，具有相互作用的可能性。DIF可明顯抑制HT1080腫瘤細(xì)胞的MMP-2、MMP-9、HIF-1α和VEGF蛋白的表達(dá)，表現(xiàn)出很好的抑制腫瘤細(xì)胞遷移的活性。

異紅藻糖苷；HT1080細(xì)胞；基質(zhì)金屬蛋白酶；低氧誘導(dǎo)因子-1α；抗腫瘤

惡性腫瘤是嚴(yán)重威脅人類健康和生命，引起人類死亡的主要疾病之一[1]。2018年，惡性腫瘤死亡人數(shù)占我國城市和農(nóng)村主要疾病總死亡人數(shù)的25.98%和22.96%[2]。腫瘤患者的高死亡率主要由于腫瘤細(xì)胞有無限增殖和侵襲轉(zhuǎn)移能力[3]，故抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移是降低患者死亡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[4]。另外，血管新生被認(rèn)為是腫瘤侵襲性的標(biāo)志[5]，因此，血管新生被認(rèn)為是引起腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵控制節(jié)點[6]。如何通過建立有效的控制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和血管新生技術(shù)，是目前抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的主要手段。在腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移過程中，基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）和基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）是通過水解腫瘤周圍基質(zhì)引起腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵蛋白，具有促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的能力[7]。在腫瘤內(nèi)部的低氧環(huán)境中，低氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）會被激活，從而促進(jìn)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的分泌[8]，進(jìn)一步刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞生長，最終導(dǎo)致血管新生[9]。因此，有效控制MMP-2和MMP-9以及HIF-1α的活性，可以在細(xì)胞水平上抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。

我國海藻資源豐富，但從中獲得有效藥用化合物尚未被完全開發(fā)。人們從不同海藻中分離得到具有活性的萜烯類[10]、生物堿類[11]、蛋白質(zhì)類[12]、多糖類[13]、酚類化合物[14]、鹵代化合物[15]等，其中海藻多糖具有抑制MMP-2和MMP-9以及HIF-1α的活性作用[16-18]。但由于海藻多糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜、支鏈多、連接方式多樣，難以獲得高純度的制品。有學(xué)者認(rèn)為多糖的生物活性可歸因于多糖的前體物質(zhì)[19]。目前，異紅藻糖苷(-Isofloridoside，DIF)，作為來源于紅藻（）[20]的一種低相對分子質(zhì)量的糖苷[21]，是海藻多糖的前體化合物之一。異紅藻糖苷是由吡喃半乳糖基和丙三醇構(gòu)成，在紅藻細(xì)胞中主要起抗?jié)B透壓作用[22]，具有抗氧化[23]、抗炎[24]、促成骨分化[25]、神經(jīng)保護[26]等活性。陳余等[21]發(fā)現(xiàn)DIF可以有效抑制人胎肝L-02細(xì)胞的氧化損傷，Ryu等[25]發(fā)現(xiàn)紅藻糖苷具有促進(jìn)小鼠骨髓間充質(zhì)細(xì)胞成骨分化的作用，翦秋麗等[27]發(fā)現(xiàn)紅藻糖苷可以抑制酪氨酸酶的活性，從而抑制黑色素的形成。本課題組前期研究[23]發(fā)現(xiàn)DIF具有抑制酒精性肝病的作用，而酒精性肝病最終會導(dǎo)致具有侵襲轉(zhuǎn)移能力的肝癌，但DIF在抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移和血管新生研究方面報道不多。

本研究旨在探究DIF是否具有潛在抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的活性作用，通過相關(guān)生化等檢測分析，探討其在腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移過程中的抑制效果，為DIF應(yīng)用于抑制腫瘤轉(zhuǎn)移抑制劑的開發(fā)提供依據(jù)，也為紅藻來源的藥物開發(fā)提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗試劑與細(xì)胞株 異紅藻糖苷（-Isofloridoside，DIF）由韓國濟州國立大學(xué)海洋科學(xué)學(xué)院提供，純度≥98%，保存溫度≤-20 ℃。人纖維肉瘤細(xì)胞HT1080購于廣州賽庫生物技術(shù)有限公司。佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯（佛波酯，PMA）和氯化鈷（CoCl2）購于上海西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司。一抗兔源HIF-1α、二抗山羊抗兔IgG購于美國Cell Signaling Technology 公司。VEGF ELISA試劑盒購于深圳欣博盛生物科技有限公司。

1.1.2 儀器和設(shè)備 酶標(biāo)儀，Bioteck儀器公司；凝膠成像系統(tǒng)和小型垂直電泳系統(tǒng)，Bio-Rad公司；全自動化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)，上海天能科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HT1080細(xì)胞培養(yǎng)在體積分?jǐn)?shù)為1%雙抗和10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，于CO2氣體體積分?jǐn)?shù)為5%，溫度37 ℃的環(huán)境中。

1.2.2 樣品毒性檢測 HT1080細(xì)胞在96孔板（1×105cell/mL，100 μL）中培養(yǎng)24 h。隨后向新鮮的無血清培養(yǎng)基中加入不同體積的DIF，使其在總體積為100 μL，溶液中的樣品濃度為10、20、50、100 μmol/L，培養(yǎng)24 h。移去培養(yǎng)基，并向每個孔中加入100 μL MTT（0.50 mg/mL），然后放入37 ℃培養(yǎng)箱中孵育4 h。移去MTT，并加入100 μL DMSO充分溶解甲瓚晶體。使酶標(biāo)儀測定（540 nm）。

1.2.3 模擬細(xì)胞遷移實驗 HT1080細(xì)胞在24孔板（1×105cell/ mL，500 μL）中培養(yǎng)24 h。用滅菌的200 μL槍頭在細(xì)胞上劃痕，用PBS沖洗掉細(xì)胞碎片。隨后向新鮮的無血清培養(yǎng)基中加入不同體積的DIF，使其在總體積為500 μL，溶液中的樣品濃度為10、20、50、100 μmol/L，然后分別在0、12、24 h觀察細(xì)胞向劃痕處遷移的情況并拍照記錄。

1.2.4 明膠酶譜分析 如1.2.3處理細(xì)胞，培養(yǎng)2 h后，加入PMA（濃度為10 μg/L）刺激。60 h后，取細(xì)胞培養(yǎng)液用BCA法定量上清液的蛋白濃度。調(diào)節(jié)蛋白含量使其相等，并利用加入體積分?jǐn)?shù)為1.50%明膠的SDS-PAGE分離蛋白。將分離后的膠放入洗脫液（2.50% TritonX-100，50 mmol/L Tris，5 mmol/L CaCl2）中除去SDS，使蛋白質(zhì)復(fù)性。然后加入孵育液（50 mmol/L Tris，200 mmol/L NaCl, 5 mmol/L CaCl2，0.02% Brij-35）置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育。60 h后，將膠放入體積分?jǐn)?shù)為0.10%考馬斯亮藍(lán)溶液中，染色2 h，最后用體積分?jǐn)?shù)為10%醋酸和40%乙醇的脫色液進(jìn)行脫色，直到觀測到藍(lán)色背景上出現(xiàn)透明條帶，并拍照記錄。

1.2.5 蛋白免疫印跡分析 HT1080細(xì)胞在6孔板（5×106cell/ mL，1 mL）中培養(yǎng)24 h。吸棄舊培養(yǎng)基。再向新鮮的無血清培養(yǎng)基中加入不同體積的DIF，使其在總體積為1 mL，溶液中的樣品濃度為20、50、100 μmol/L。培養(yǎng)2 h后，加入CoCl2（濃度為100 μmol/L）刺激。24 h后，吸棄舊培養(yǎng)基，用滅菌的4 ℃預(yù)冷的PBS洗滌，并加入100 μL含有10 mmol/L PMSF的RIPA裂解緩沖液，在冰上裂解0.5 h。用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白含量，并通過SDS-PAGE和轉(zhuǎn)移膜處理，將目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素（NC）膜上。然后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂牛奶封閉2 h、一抗4 ℃孵育12 h、二抗孵育2 h，最后利用顯色觀察并拍照記錄。

1.2.6 酶聯(lián)免疫分析 如1.2.4處理細(xì)胞，培養(yǎng)2 h后，加入CoCl2（濃度為100 μmol/L）刺激。24 h后，提取培養(yǎng)基，根據(jù)酶聯(lián)免疫試劑盒說明書制作VEGF標(biāo)準(zhǔn)曲線。并選取合適稀釋倍數(shù)的上清稀釋液進(jìn)行實驗，檢測不同濃度樣品處理細(xì)胞后，VEGF釋放到培養(yǎng)基中分泌量。根據(jù)測量數(shù)據(jù)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算VEGF的分泌量。

1.2.7 分子對接 采用Autodock vina軟件進(jìn)行半柔性對接[28]，先用Chemdraw和Chem3D軟件構(gòu)建了配體(DIF)的3D結(jié)構(gòu)，并確定其能量最小的構(gòu)象；利用Autodock Tools軟件確定配體可旋轉(zhuǎn)鍵。從PDB數(shù)據(jù)庫中下載MMP-2 (PDB ID: 3AYU)、MMP-9 (PDB ID: 5TH6)和HIF-1α (PDB ID: 1H2N)的X-ray的晶體三維結(jié)構(gòu)；用Autodock Tools軟件對受體蛋白的3D結(jié)構(gòu)進(jìn)行加氫，并確定蛋白的結(jié)合中心位置和范圍得到相應(yīng)的參數(shù)文件。采用Autodock vina軟件進(jìn)行分子對接，得到的結(jié)果用軟件進(jìn)行結(jié)果分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用Image J、Graphpad Prism 5.0、Pymol和SPSS statistics 25軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析及制圖。所有實驗結(jié)果以平均值 ± SD表示，顯著性差異使用單因素方差分析(one-way ANOVA)和-test分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 DIF對HT080細(xì)胞的毒性作用

圖1中，與不加DIF的空白組相比，加入DIF（10 ~ 100 μmol/L）的實驗組的細(xì)胞存活率無明顯變化（> 0.05）。說明DIF（10 ~ 100 μmol/L）對HT1080細(xì)胞無毒性作用，可選擇該濃度下的DIF做后續(xù)實驗。

不同小寫字母表示差異顯著（P < 0.05）

2.2 DIF對HT1080細(xì)胞遷移的作用

通過細(xì)胞劃痕實驗檢測DIF對HT1080細(xì)胞遷移的作用（圖2），經(jīng)過12 h和24 h處理后，與不加DIF的空白組相比，加入10 μmol/L DIF的實驗組的細(xì)胞，遷移能力無明顯變化（> 0.05）；加入20 ~ 100 μmol/L DIF的實驗組的細(xì)胞，隨著濃度的增加，遷移能力極顯著下降（< 0.01）。這說明DIF具有降低HT1080腫瘤細(xì)胞的遷移能力的作用。

2.3 DIF對MMP-2和MMP-9活性的作用

通過明膠酶譜實驗檢測MMP-2和MMP-9的酶活性（圖3），與未加DIF和PMA誘導(dǎo)劑的空白組相比，加入PMA的對照組的MMP-2和MMP-9的酶活性有極顯著增加（< 0.01）。與對照組相比，加入10 μmol/L DIF的實驗組的MMP-2的酶活性無明顯變化（> 0.05），加入20 ~ 100 μmol/L DIF的細(xì)胞的MMP-2的酶活性極顯著下降（< 0.01）；而加入10 ~ 100 μmol/L DIF的細(xì)胞的MMP-9的酶活性極顯著下降（< 0.01），且呈濃度依賴性。這說明DIF具有抑制HT1080腫瘤細(xì)胞分泌的MMP-2和MMP-9酶活性的作用，且呈濃度依賴性。

2.4 DIF對HIF-1α表達(dá)的作用

通過蛋白免疫印跡實驗測定DIF對HIF-1α表達(dá)的作用（圖4），與不加DIF和CoCl2誘導(dǎo)劑的空白組相比，加入CoCl2的對照組的HIF-1α蛋白表達(dá)量有極顯著增加（< 0.01）。與對照組相比，加入50 ~ 100 μmol/L DIF的HIF-1α蛋白的表達(dá)量極顯著減少（< 0.01）。這說明DIF有抑制HT1080腫瘤細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)的作用，且呈濃度依賴性。

空白組，不加入PMA與DIF；對照組，加入10 μg/L PMA；實驗組1，加入10 μg/L PMA與10 μmol/L DIF；實驗組2，加入10 μg/L PMA與20 μmol/L DIF；實驗組3，加入10 μg/L PMA與50 μmol/L DIF；實驗組4，加入10 μg/L PMA與100 μmol/L DIF；不同小寫字母表示差異顯著（< 0.05）；不同大寫字母表示差異極顯著（< 0.01）

圖3 DIF對MMP-2和MMP-9活性的作用

Fig. 3 The effect of DIF on MMP-2 and MMP-9 activity

2.5 DIF對VEGF分泌量的作用

通過酶聯(lián)免疫實驗測定DIF對VEGF分泌量的影響（圖5），與不加DIF和CoCl2誘導(dǎo)劑的空白組相比，加入CoCl2的對照組的VEGF分泌量有顯著增加（< 0.05）。與對照組相比，加入20 ~ 100 μmol/L DIF細(xì)胞的VEGF分泌量極顯著下降（< 0.01）。這說明DIF具有減少HT1080腫瘤細(xì)胞VEGF分泌量的作用。

空白組，不加入PMA與DIF；對照組，加入10 μg/L PMA；實驗組1，加入10 μg/L PMA與10 μmol/L DIF；實驗組2，加入10 μg/L PMA與20 μmol/L DIF；實驗組3，加入10 μg/L PMA與50 μmol/L DIF；實驗組4，加入10 μg/L PMA與100 μmol/L DIF；不同小寫字母表示差異顯著（P < 0.05）；不同大寫字母表示差異極顯著（P < 0.01）

2.6 DIF與MMP-2、MMP-9和HIF-1α的分子相互作用預(yù)測

利用分子對接檢測DIF與MMP-2、MMP-9和HIF-1α蛋白之間的相互作用。通過Autodock vina軟件得到DIF與MMP-2、MMP-9和HIF-1α蛋白的可能結(jié)合位點，取結(jié)合能最小值的構(gòu)象作為最佳構(gòu)象結(jié)果。如圖6所示，DIF與MMP-2的對接結(jié)合能為-26.79 kJ/mol，與Ala83、Leu82和His130形成3個氫鍵，鍵長分別為3.60 × 10-10m、3.80 × 10-10m和5.30 × 10-10m。如圖7所示，DIF與MMP-9的對接結(jié)合能為-28.88 kJ/mol，與Pro421、Met422、Arg424和Pro415形成4個氫鍵，鍵長分別為5.20 × 10-10m、5.40 × 10-10m、4.40 × 10-10m和5.50×10-10m。如圖8所示，DIF與HIF-1α的對接結(jié)合能為-27.21 kJ/mol，與Phe100、Ser118、Gln147、His199和Asp201形成7個氫鍵，鍵長分別為4.00 × 10-10m、4.60 × 10-10m、5.20 × 10-10m、5.20 × 10-10m、5.50 × 10-10m、5.10 × 10-10m和4.80 × 10-10m。

圖7 DIF與MMP-9的分子對接三維圖和二維圖

圖8 DIF與HIF-1α的分子結(jié)合位點預(yù)測三維圖和二維圖

3 討論

紅藻糖苷在紅藻中存在的種類以及含量受生長環(huán)境、地域以及紅藻種類的影響[29]。紅藻糖苷與異紅藻糖苷的結(jié)構(gòu)均由吡喃半乳糖基和丙三醇構(gòu)成，但主要區(qū)別是二者連接位置不同。本研究發(fā)現(xiàn)，從紅藻（）中提取的異紅藻糖苷具有明顯抑制MMP-2、MMP-9和HIF-1α活性的作用。MTT和劃痕實驗結(jié)果，證實DIF在對細(xì)胞無明顯毒性作用的濃度下，具有極顯著降低HT1080腫瘤細(xì)胞遷移能力的活力（< 0.01）。MMP-2和MMP-9作為腫瘤細(xì)胞遷移的關(guān)鍵水解酶，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞向周圍基質(zhì)轉(zhuǎn)移的作用[30]。MMP-2和MMP-9的活性與腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力呈正相關(guān)，而DIF可以極顯著抑制MMP-2和MMP-9的表達(dá)（< 0.01），從而控制腫瘤細(xì)胞對周圍基質(zhì)的水解作用，使腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力下降。HIF-1α具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生VEGF，從而導(dǎo)致腫瘤周圍血管新生的作用[31]。通過對HIF-1α和VEGF蛋白表達(dá)的檢測發(fā)現(xiàn)，DIF可以極顯著降低HIF-1α和VEGF蛋白的表達(dá)（< 0.01），具有進(jìn)一步降低腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。通過預(yù)測DIF與MMP-2、MMP-9和HIF-1α分子間的結(jié)合位點。本研究發(fā)現(xiàn)，DIF與MMP-2、MMP-9和HIF-1α均能形成穩(wěn)定的氫鍵，這可能是DIF抑制相關(guān)蛋白表達(dá)的內(nèi)在原因。

4 結(jié)論

DIF可有效控制MMP-2、MMP-9、HIF-1α和VEGF的表達(dá)，抑制HT080腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。大分子結(jié)構(gòu)預(yù)測分析，間接證實DIF與MMP-2、MMP-9和HIF-1α具有結(jié)合位點。因此，DIF具有成為腫瘤預(yù)防功能性食品或治療藥物的潛力。

[1] XU J, DU Y, LIU W J, et al. Intensive fibrosarcoma-binding capability of the reconstituted analog and its antitumor activity[J]. Drug Delivery, 2018, 25(1): 102-111.

[2] 國家統(tǒng)計局. 2018年我國城市和農(nóng)村居民主要疾病死因構(gòu)成統(tǒng)計表[DB/OL]. 2020 [2020-05-15]. http://data.stats.gov.cn/easyquery.htm?cn=C01.

[3] 肖青雯, 陸金健, 陳修平. 靶向上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化: 中藥抗腫瘤轉(zhuǎn)移和器官纖維化新策略[J]. 醫(yī)藥導(dǎo)報, 2018, 37(4): 401-409.

[4] 陳平圣. 腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移機制及其防治對策[J]. 現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生, 2004, 20(8): 595-596.

[5] 伊日貴, 徐曉艷, 李時榮. 腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移機制研究進(jìn)展[J]. 中華實用診斷與治療雜志, 2014, 28(10): 937-939.

[6] KIM A, IM M, GU M J, et al. Ethanol extract ofexhibits anti-cancer activity in human cancer cells by suppression of metastatic and angiogenic potential[J]. Scientific Reports, 2016, 6: 36277.

[7] BAE M J, KARADENIZ F, OH J H, et al. MMP-inhibitory effects of flavonoid glycosides from edible medicinal halophyte[J]. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 2017, 2017: 6750274.

[8] KIM A, MA J Y. Rhaponticin decreases the metastatic and angiogenic abilities of cancer cells via suppression of the HIF?1α pathway[J]. International Journal of Oncology, 2018, 53(3): 1160-1170.

[9] FARZANEH BEHELGARDI M, ZAHRI S, MASHAYEKHI F, et al. A peptide mimicking the binding sites of VEGF-A and VEGF-B inhibits VEGFR-1/-2 driven angiogenesis, tumor growth and metastasis[J]. Scientific Reports, 2018, 8(1): 17924.

[10] GAYSINSKI M, ORTALO-MAGNé A, THOMAS O P, et al. Extraction, purification, and NMR analysis of terpenes from brown algae[J]. Natural Products from Marine Algae, 2015, 1308: 207-223.

[11] LUCENA A M M, SOUZA C R M, JALES J T, et al. The bisindole alkaloid caulerpin, from seaweeds of the genus, attenuated colon damage in murine colitis model[J]. Marine Drugs, 2018, 16(9): 318.

[12] PIMENTEL F B, ALVES R C, HARNEDY P A, et al. Macroalgal-derived protein hydrolysates and bioactive peptides: enzymatic release and potential health enhancing properties[J]. Trends in Food Science and Technology, 2019, 93: 106-124.

[13] ZHANG R, ZHANG X X, TANG Y X, et al. Composition, isolation, purification and biological activities ofpolysaccharides: a review[J]. Carbohydrate Polymers, 2020, 228: 115381.

[14] SANTOS S A O, FéLIX R, PAIS A C S, et al. The quest for phenolic compounds from macroalgae: a review of extraction and identification methodologies[J]. Biomolecules, 2019, 9(12): 847.

[15] SHILLING A, VON SALM J L, SANCHEZ A, et al. Anverenes B–E, new polyhalogenated monoterpenes from the Antarctic red alga[J]. Marine Drugs, 2019, 17(4): 230.

[16] ABU R, JIANG Z D, UENO M, et al. Anti-metastatic effects of the sulfated polysaccharide ascophyllan isolated fromon B16 melanoma[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2015, 458(4): 727-732.

[17] HLAWATY H, SUFFEE N, SUTTON A, et al. Low molecular weight fucoidan prevents intimal hyperplasia in rat injured thoracic aorta through the modulation of matrix metalloproteinase-2 expression[J]. Biochemical Pharmacology, 2011, 81(2): 233-243.

[18] CHEN M C, HSU W L, HWANG P A, et al. Low molecular weight fucoidan inhibits tumor angiogenesis through down regulation of HIF-1/VEGF signaling under hypoxia[J]. Marine Drugs, 2015, 13(7): 4436-4451.

[19] LEBBAR S, FANUEL M, LE GALL S, et al. Agar extraction by-products fromas a source of glycerol-galactosides[J]. Molecules, 2018, 23(12): 3364.

[20] LI Y X, LI Y, LEE S H, et al. Inhibitors of oxidation and matrix metalloproteinases, floridoside, and D-isofloridoside from marine red alga[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2010, 58(1): 578-586.

[21] 陳余, 蔣麗剛, 李九零, 等. 紅藻糖苷對人胎肝L-02細(xì)胞抗氧化作用的研究[J]. 營養(yǎng)學(xué)報, 2016, 38(6): 607-609.

[22] OCHSENKüHN M A, R?THIG T, D’ANGELO C, et al. The role of floridoside in osmoadaptation of coral-associated algal endosymbionts to high-salinity conditions[J]. Science Advances, 2017, 3(8): e1602047.

[23] YANG S T, CHEN M F, RYU B, et al. The protective effect of the polysaccharide precursor, D-isofloridoside, fromon alcohol-induced hepatotoxicity in HepG2 cells[J]. Molecules, 2020, 25(5): 1024.

[24] KIM M, LI Y X, DEWAPRIYA P, et al. Floridoside suppresses pro-inflammatory responses by blocking MAPK signaling in activated microglia[J]. BMB Reports, 2013, 46(8): 398-403.

[25] RYU B, LI Y X, KANG K, et al. Floridoside fromundulata promotes osteogenic differentiation in murine bone marrow mesenchymal cells[J]. Journal of Functional Foods, 2015, 19(19): 505-511.

[26] BARBOSA M, VALENT?O P, ANDRADE P B. Bioactive compounds from macroalgae in the new millennium: implications for neurodegenerative diseases[J]. Marine Drugs, 2014, 12(9): 4934-4972.

[27] 翦秋麗, 蔣麗剛, 嚴(yán)江燕, 等. 紅藻糖苷抑制黑色素形成的作用研究[J]. 生物學(xué)雜志, 2017, 34(5): 39-42.

[28] SEELIGER D, GROOT B L. Ligand docking and binding site analysis with PyMOL and Autodock/Vina[J]. Journal of Computer-Aided Molecular Design, 2010, 24(5): 417-422.

[29] 崔曉山, 陳娟娟, 楊銳, 等. 紅藻中紅藻糖苷的研究進(jìn)展[J]. 海洋科學(xué), 2018, 42(4): 162-169.

[30] 張陳. 從海洋藻類中分離抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和MMP-2和-9的表達(dá)的化合物[D]. 長春: 吉林大學(xué), 2012.

[31] MABJEESH N J, AMIR S. Hypoxia-inducible factor (HIF) in human tumorigenesis[J]. Histology and Histopathology, 2007, 22(5): 559-572.

Effects of-Isofloridoside on Invasion and Metastasis of HT1080 Tumor Cells

YANG Sheng-tao1, CHEN Jia-li1, LIU Yi2, XIAO Zhen-bang2, HONG Peng-zhi1,3, ZHOU Chun-xia1,3

（1.,////,524088,; 2.,,524088,; 3.(),524025,）

To analyze the effect of-Isofloridoside (DIF) on the invasion and metastasis effect of HT1080 tumor cells.MTT method was used to evaluate cell survival. Cell scratch test was used to detect cell migration ability. Gelatin zymography test was used to detect the activity of matrix metalloproteinases-2 (MMP-2) and matrix metalloproteinases-9 (MMP-9). Western blot was used to detect hypoxia-inducible factor-1α (HIF-1α) expression. ELISA was used to detect the release of vascular endothelial growth factor (VEGF). The interaction between DIF with MMP-2, MMP-9 and HIF-1α proteins was predicted by molecular docking.The MTT and scratch test have confirmed that DIF has no significant toxic effect on HT1080 cells (> 0.05). It can significantly reduce the ability of tumor cells to migrate in vitro (< 0.01). Compared with the control group, increase DIF concentration caused a significant reduction of MMP-2 and MMP-9 activities and the expression of HIF-1α and VEGF proteins was significantly reduced (< 0.01). The simulation results of molecular docking indicate that DIF can form stable hydrogen bonds with MMP-2, MMP-9 and HIF-1α, and has the possibility of interaction.DIF significantly inhibit the expression of MMP-2, MMP-9, HIF-1α and VEGF protein in HT1080 tumor cells, and show good activity in inhibiting tumor cell migration. These results can provide a theoretical basis for further study of DIF as a potential antitumor active substance.

-isofloridoside; HT1080 cells; matrix metalloproteinases; HIF-1α; antitumor

Q291; R738.7

A

1673-9159（2020）06-0116-07

10.3969/j.issn.1673-9159.2020.06.015

楊勝濤，陳佳麗，劉怡，等. 異紅藻糖苷對HT1080腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移作用的影響[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報，2020，40（6）：116-122.

2020-03-11

南方海洋科學(xué)與工程廣東省實驗室（湛江）資助項目（ZJW-2019-07）；湛江市海洋經(jīng)濟創(chuàng)新發(fā)展示范市建設(shè)項目（湛海創(chuàng)2017C8B1）

楊勝濤（1996－），男，碩士研究生，研究方向為水產(chǎn)品高值化加工與利用。Email: 15766385620@163.com

周春霞（1979－），女，副教授，博士，研究方向為水產(chǎn)品加工與貯藏。Email: chunxia.zhou@163.com