向家培 雷玉華

心肌纖維化是心臟在多種刺激因素下的適應(yīng)性反應(yīng)[1]。心肌梗死發(fā)生后，心肌纖維化過(guò)程立即啟動(dòng)，大量死亡的心肌細(xì)胞被激活的成纖維細(xì)胞替代，膠原瘢痕形成，保證了心臟組織的完整性[2]。心肌梗死早期纖維化瘢痕形成有助于心肌梗死患者渡過(guò)危險(xiǎn)期，此時(shí)若纖維化不足可導(dǎo)致心臟破裂，患者死亡[3]。心肌梗死后期，大量的心肌纖維化會(huì)使室壁壓力增加，單個(gè)心肌細(xì)胞所承受的壓力增大，室壁僵硬度增加，若此時(shí)纖維化持續(xù)發(fā)生將引起心力衰竭(心衰)[4-5]。在心臟纖維化過(guò)程中，除了心臟固有的成纖維細(xì)胞發(fā)揮作用外，大量其他來(lái)源的成纖維細(xì)胞也發(fā)揮重要作用，其中內(nèi)皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化占主導(dǎo)作用。研究阻斷纖維化以及內(nèi)皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化的藥物，對(duì)減少心肌梗死后心衰的患病率和病死率有重要意義。

CTRP6是一類(lèi)與脂聯(lián)素同源的脂肪因子[6]，在心血管疾病中發(fā)揮一定作用[7]。研究發(fā)現(xiàn)，CTRP6可以保護(hù)自發(fā)性高血壓大鼠的內(nèi)皮細(xì)胞，從而抑制高血壓的病理過(guò)程[8]。然而CTRP6在心肌纖維化尤其是內(nèi)皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用尚無(wú)研究報(bào)道。本研究采用人重組CTRP6治療小鼠心肌梗死后心臟纖維化，以此來(lái)探尋治療心肌纖維化的新方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

將購(gòu)買(mǎi)于南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物中心的雄性C57BL/6J小鼠(8～10周齡，SPF級(jí)，體質(zhì)量24～27 g)采用隨機(jī)數(shù)字表法完全隨機(jī)分為對(duì)照組(n=10)、心肌梗死組(n=20)和治療組(n=20)。

1.2 心肌梗死模型制備

采用冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎術(shù)建立心肌梗死模型。用3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠，在胸骨左緣縱行切開(kāi)皮膚1.5 cm，暴露心臟，在左心耳下緣2～3 mm處用8-0聚丙烯縫線結(jié)扎冠狀動(dòng)脈，心電圖ST段抬高確定心肌缺血形成。迅速將心臟送回胸腔，縫合胸壁。治療組在心肌梗死手術(shù)后第3天開(kāi)始給予皮下注射人重組CTRP6(0.2 mg/kg)，直至術(shù)后第28天。

1.3 超聲心動(dòng)圖檢測(cè)

使用高頻率超聲系統(tǒng)Vevo 2100(加拿大 VisualSonics 公司)檢測(cè)小鼠心臟功能。M型短軸二維超聲心動(dòng)圖測(cè)量左室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)、左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)、左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、左室短軸縮短率(LVFS)。

1.4 病理染色

小鼠斷椎處死，取心臟置于中性福爾馬林中固定，脫水石蠟包埋后制作成厚度為3 μm的組織切片，蘇木精-伊紅(HE)染色后計(jì)算心肌梗死面積和細(xì)胞橫截面積，采用天狼猩紅(PSR)染色顯示膠原沉積程度。每個(gè)心臟選取位置大致相同的心室截面，用ImageJ軟件計(jì)算心肌梗死面積、細(xì)胞橫截面積和膠原容積分?jǐn)?shù)。心肌梗死陽(yáng)性面積百分率=心肌梗死陽(yáng)性面積/檢測(cè)視野面積×100%，取各組陽(yáng)性面積百分率平均值。

1.5 原代小鼠心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞提取

取6～8周小鼠心臟，去除右心室，將心臟剪成1 mm3的小塊，采用0.125%的胰酶消化，過(guò)濾后取上清，離心細(xì)胞懸液，用含10%胎牛血清的DMEM-F12重懸細(xì)胞，采用CD31磁珠分選內(nèi)皮細(xì)胞，得到的內(nèi)皮細(xì)胞接種于包埋明膠的培養(yǎng)板中。

1.6 細(xì)胞處理

將內(nèi)皮細(xì)胞分為5組：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1刺激組，給予TGF-β1(10 ng/mL，溶于0.1%BSA)處理48 h；治療組1，TGF-β1處理后的12 h同時(shí)給予1 μg/mL CTRP6；治療組2，TGF-β1處理后的12 h同時(shí)給予2 μg/mL CTRP6；治療組3，TGF-β1處理后的12 h同時(shí)給予4 μg/mL CTRP6；對(duì)照組，給予等體積的0.1%BSA溶液處理48 h。

1.8 細(xì)胞免疫熒光染色

細(xì)胞處理后采用4%多聚甲醛進(jìn)行固定，采用0.02% TritonX-100進(jìn)行破膜，8%羊血清封閉后，抗CD31抗體和抗平滑肌肌動(dòng)蛋白α(α-SMA)抗體孵育1 h，采用熒光二抗進(jìn)行標(biāo)記，DAPI對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，熒光顯微鏡拍照。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)。計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，正態(tài)檢驗(yàn)及方差齊性檢驗(yàn)后，兩組之間的比較用非配對(duì)t檢驗(yàn)或Mann-Whitney檢驗(yàn)，多組之間的比較用單因素方差分析或非參數(shù)檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線圖。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CTRP6降低小鼠心肌梗死死亡率和梗死面積，改善心功能

采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線圖，可見(jiàn)治療組小鼠死亡率顯著低于心肌梗死組(40%對(duì)60%，P<0.05)，見(jiàn)圖1。病理染色示治療組小鼠梗死面積明顯低于心肌梗死組(P<0.05)。治療組小鼠心功能明顯優(yōu)于心肌梗死組：LVEF和LVFS明顯高于心肌梗死組，LVEDD和LVESD明顯低于心肌梗死組(P均<0.05)，見(jiàn)表1。

圖 1 心肌梗死后28 d兩組小鼠的死亡率曲線

表1 各組小鼠心肌梗死面積和心功能比較

2.2 CTRP6減少心肌纖維化和纖維化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄

天狼星紅染色提示治療組小鼠心臟膠原沉積明顯低于心肌梗死組(P均<0.05)。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，治療組小鼠心臟Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原和TGF-β1的mRNA表達(dá)水平低于心肌梗死組(P均<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠心肌膠原蛋白沉積及心臟纖維化標(biāo)志物mRNA水平比較

2.3 CTRP6減少內(nèi)皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化

CD31和α-SMA免疫熒光雙染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，心肌梗死組小鼠心臟組織微血管CD31表達(dá)減少，而α-SMA表達(dá)增多；治療組小鼠心臟組織微血管CD31表達(dá)高于心肌梗死組，而α-SMA表達(dá)低于心肌梗死組，見(jiàn)圖2。

采用qRT-PCR檢測(cè)內(nèi)皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志物snail1、snail2、twist1和twist2的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示心肌梗死組小鼠心臟組織snail1、snial2、twist1和twist2的mRNA表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組(P均<0.05)；治療組中小鼠心臟組織snail1、snial2、twist1和twist2的mRNA表達(dá)水平均明顯低于心肌梗死組(P均<0.05)，見(jiàn)表3。

注：紅色表示CD31，綠色表示α-SMA，藍(lán)色表示細(xì)胞核

表3 各組小鼠心臟組織內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志物mRNA水平比較

2.4 CTRP6對(duì)微血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響

CD31和α-SMA免疫熒光雙染色結(jié)果顯示，TGF-β1刺激組細(xì)胞CD31的表達(dá)低于對(duì)照組，α-SMA的表達(dá)高于對(duì)照組。治療組1、治療組2和治療組3細(xì)胞CD31的表達(dá)均明顯高于TGF-β1刺激組，α-SMA的表達(dá)均低于TGF-β1刺激組，見(jiàn)圖3。

采用RT-PCR檢測(cè)內(nèi)皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志物的mRNA表達(dá)水平，可見(jiàn)TGF-β1刺激組細(xì)胞snail1、snial2、twist1和twist2的mRNA表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組，治療組1、治療組2和治療組3細(xì)胞snail1、snial2、twist1和twist2的mRNA表達(dá)水平均明顯低于TGF-β1刺激組(P均<0.05)，見(jiàn)表4。

注：紅色表示CD31，綠色表示α-SMA，藍(lán)色表示細(xì)胞核

表4 各處理組心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志物mRNA水平比較

3 討論

心衰是多種心血管疾病的終末病理狀態(tài)，以間質(zhì)纖維化、心室壁順應(yīng)性降低、心室重構(gòu)為主要特征。急性心肌梗死后存活的患者多會(huì)發(fā)展為心衰。在心肌梗死發(fā)展為心衰的病理過(guò)程中，心臟成纖維細(xì)胞大量激活，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)沉積，降低心臟組織順應(yīng)性，加速心衰的發(fā)生[4- 5]。多種細(xì)胞參與心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展，包括心臟成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、造血干細(xì)胞等，其中內(nèi)皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化在心肌纖維化中發(fā)揮重要作用[9-10]。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)抑制內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化可以抑制心肌纖維化的發(fā)展[11-13]。本研究發(fā)現(xiàn)，人重組脂肪因子CTRP6能夠減小心肌梗死面積，減少心肌梗死后的心肌纖維化水平，從而改善心肌梗死后心功能。我們發(fā)現(xiàn)CTRP6通過(guò)減少內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化抑制心肌梗死后心肌纖維的發(fā)展，離體實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)CTRP6直接作用于內(nèi)皮細(xì)胞，抑制TGF-β1誘導(dǎo)的內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

內(nèi)皮細(xì)胞失去內(nèi)皮標(biāo)志物(如CD31、CD34)，獲得間充質(zhì)或肌纖維母細(xì)胞表型，表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)物(如α-SMA和Ⅰ型膠原)，獲得浸潤(rùn)性生長(zhǎng)以及遷徙能力，這一過(guò)程稱(chēng)為內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[14]。內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化參與多種疾病的發(fā)生，如腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移、腫瘤惡變以及心肌纖維化[11]。研究發(fā)現(xiàn)在壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌重構(gòu)中，有27%～33%的成纖維細(xì)胞來(lái)源于發(fā)生內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的內(nèi)皮細(xì)胞，這促進(jìn)了心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展[15]。抑制內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化可以緩解多種疾病狀態(tài)下的心肌纖維化和心臟重構(gòu)[11-13]。Liu等[12]發(fā)現(xiàn)柴胡皂甙A通過(guò)抑制內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化減輕壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌纖維化。Wang等[11]發(fā)現(xiàn)微小RNA(miRNA)-222通過(guò)抑制內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化減輕糖尿病心肌病的心肌纖維化。Zhang等[16]發(fā)現(xiàn)色素上皮衍生因子通過(guò)抑制內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化減輕急性心肌梗死大鼠心肌纖維化。因此抑制內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化可能是治療心血管疾病心肌纖維化的靶點(diǎn)。CTRP6主要來(lái)源于脂肪細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞[6]，可以抑制多種刺激因素引起的高血壓病理進(jìn)程[8]。CTRP6缺失可導(dǎo)致小鼠胰島素抵抗和炎性反應(yīng)[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，CTRP6能夠減少心肌梗死面積，減輕梗死后的心肌纖維化，改善心功能，而CTRP6是通過(guò)減少內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化發(fā)揮抗纖維化作用的。

心肌梗死后，損傷的心肌細(xì)胞通過(guò)分泌損傷相關(guān)分子促進(jìn)多種炎性因子和促纖維化因子大量釋放，其中TGF-β1是最強(qiáng)的致纖維化因子之一[18]。TGF-β1可以直接激活纖維化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，包括Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、纖維連接蛋白、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子等，直接參與纖維化過(guò)程[18]。此外，TGF-β1可以結(jié)合內(nèi)皮細(xì)胞表面的TGF-β1受體，通過(guò)Smad和非Smad通路促進(jìn)內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化基因snial1、snail1、twist1和twist2 的轉(zhuǎn)錄，這些基因可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞高表達(dá)間質(zhì)標(biāo)志物α-SMA和波形蛋白，同時(shí)減少內(nèi)皮標(biāo)志物CD31的表達(dá)[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，在心肌梗死后心肌纖維化的過(guò)程中，內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化明顯增加；人重組CTRP6可以通過(guò)直接作用于內(nèi)皮細(xì)胞，抑制TGF-β1誘導(dǎo)的內(nèi)皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化，減少心肌纖維化的發(fā)展，這提示CTRP6通過(guò)抑制TGF-β1誘導(dǎo)的內(nèi)皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化，發(fā)揮心臟保護(hù)作用。