徐婭玲 馮晉 楊瓊英 周曉楠 何芳雁

摘要：目的 通過比較天麻活性成分對羥基苯甲醛（4-hydroxybenzaldehyde，4-HBd）對腦缺血再灌注損傷模型大鼠皮層區(qū)氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的影響，探討4-HBd抗神經(jīng)細胞凋亡的可能機制。方法 采用線栓復(fù)制大鼠大腦中動脈阻塞/再灌注（MCAO/R）模型，于腦缺血2h再灌注2h給予受試物，用微透析腦探針動態(tài)采集各組大鼠不同時間點皮層區(qū)腦透析液，以HPLC-FLD法檢測谷氨酸（Glu）、天門冬氨酸（Asp）、γ-氨基丁酸（GABA）、甘氨酸（Gly）的含量并進行比較。結(jié)果 與MCAO/R模型組比較，4-HBd能降低模型大鼠腦透析液中0.25h-6h、10h-24h Glu水平（P<0.05，P<0.01），但Asp、GABA和Gly水平無明顯變化。結(jié)論 4-HBd對抗神經(jīng)細胞凋亡的作用可能與通過降低EAA類神經(jīng)遞質(zhì)Glu水平有關(guān)。

關(guān)鍵詞：腦缺血再灌注損傷;對羥基苯甲醛;氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)

中圖分類號：R285.5 文獻標志碼：A 文章編號：1007-2349（2020）09-0061-06

Effect of P-hydroxybenzaldehyde on Amino Acid Neurotransmitters in the Cortexof Rats with Cerebral Ischemia-Reperfusion Injury

XU Ya-ling，F(xiàn)ENG Jin，YANG Qiong-ying，ZHOU Xiao-nan，HE Fang-yan

（Yunnan University of Traditional Chinese Medicine，Kunming 650500，China）

【Abstract】Objective： To compare the effect of 4-hydroxybenzaldehyde（4-HBd），an active ingredient of Gastrodia elata，on amino acid neurotransmitters in the cortex of rats with cerebral ischemia-reperfusion injury and to explore the possible mechanism of death of 4-HBd on neuronal apoptosis. Methods： The middle cerebral artery occlusion/reperfusion（MCAO/R）model rats was replicated with suture. The test substance was administered after 2 hours of cerebral ischemia and 2 hours of reperfusion. The rats of each group were dynamically collected at different time points with a microdialysis brain probe. HPLC-FLD was used to detect and compare the contents of glutamic acid（Glu），aspartic acid（Asp），γ-aminobutyric acid（GABA）and glycine（Gly）. Results： Compared with the MCAO/R model group，4-HBd can reduce the 0.25h-6h，10h-24h Glu levels in the brain dialysis fluid of model rats（P<0.05，P<0.01），but Asp，GABA and Gly levels had no significant changes. Conclusion： The effect of 4-HBd on neuronal apoptosis may be related to reducing the level of EAA neurotransmitter Glu.

【Key words】cerebral ischemia-reperfusion injury，p-hydroxybenzaldehyde，amino acid neurotransmitters

中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的興奮性氨基酸（Excitatory amino acids，EAA）和抑制性氨基酸（Inhibitory amino acids，IAA）在腦內(nèi)維持興奮-抑制平衡，對認知、運動等功能具有重要的調(diào)節(jié)作用[1]。在缺血性腦卒中（Ischemic stroke，IS）病理過程中，EAA和IAA類神經(jīng)遞質(zhì)平衡的破壞，可引發(fā)一系列病理生理改變，最終導(dǎo)致神經(jīng)細胞的凋亡或壞死。因此，調(diào)節(jié)腦內(nèi)氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的動態(tài)平衡是防治IS的重要途徑[2]。

對羥基苯甲醛（4-hydroxybenzaldehyde，4-HBd）是天麻抗IS作用的主要活性成分之一，對大鼠腦缺血再灌注損傷有保護作用，能對抗神經(jīng)細胞的凋亡[3]。本研究利用微透析采樣技術(shù)聯(lián)合HPLC-FLD分析方法考察4-HBd對大鼠MCAO/R模型大鼠腦皮層區(qū)氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)動態(tài)變化的影響，探討其對抗神經(jīng)細胞凋亡的可能機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 雄性SD大鼠，SPF級，體重200～240g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限司提供。生產(chǎn)許可證號SCXK（湘）2016-0002。

1.2 實驗試劑 對羥基苯甲醛（純度99.89%）由北京百靈威科技有限公司提供;谷氨酸（Glu）、天門冬氨酸（ASP）、甘氨酸（Gly）、γ-氨基丁酸（GABA）標準品、鄰苯二甲醛（OPA）均由美國Sigma公司提供;MCAO栓線，北京西濃有限公司;水合氯醛，天津市科密歐化學試劑有限公司;四氫呋喃（THF）、2-巰基乙醇（2-MCE）、硼酸，上海阿拉丁生化科技股份有限公司;甲醇（色譜純），賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.3 實驗儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀，美國Agilent公司;Secura2250分析天平，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司;XW-80A渦旋混勻振蕩器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司;BASi微透析儀，美國BASi公司。

2 實驗方法

2.1 腦微透析套管植入手術(shù)以及腦透析液的采集 取SD大鼠以10%水合氯醛（300mg/kg）腹腔注射麻醉，俯臥固定在腦立體定位儀上，用手術(shù)恒溫加熱墊保持大鼠體溫在（37±0.5）℃。沿大鼠腦正中剪開頭皮，充分暴露頭骨。按大鼠腦圖譜（Paxinos and Watson，6TH Ediyion），以前囟作為定位基點，右側(cè)大腦皮層區(qū)（坐標為AP：+3.2mm;ML：+0.4mm;DV：3.0mm），并植入腦微透析套管。術(shù)后觀察3d，即可進行采樣。

大鼠放置于微透析儀的清醒活動裝置內(nèi)，將脖套與平衡臂相連，以人工腦脊液為灌流液，于0、0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5、1.75、2、2.5、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h進行取樣。

2.2 MCAO/R模型的復(fù)制 采用線栓法復(fù)制大鼠MCAO/R模型[4-5]。復(fù)制方法如下：以10%水合氯醛（300mg/kg）腹腔注射麻醉，沿頸正中偏右處切口，分離大鼠右側(cè)頸總動脈（CCA）和迷走神經(jīng)。結(jié)扎CCA近心端，并剪一“V”型小口，CCA遠心端用動脈夾夾閉，栓線經(jīng)缺口插入，使尼龍線頭端通過大腦中動脈（MCA）起始處，到達較細的大腦前動脈，線栓插入深度為18-20mm，微遇阻力時停止。MCAO后2h時緩慢的輕拉尼龍線使其頭端回到頸總動脈內(nèi)，完成大鼠MCAO/R模型。

2.3 大鼠MCAO/R模型的評價 參照Longa并加以改良的5分法[6]進行評分：模型成功的標準：排除為無癥狀0分和嚴重缺損癥狀4分的大鼠，視評分為1～3分的動物為模型成功。

2.4 實驗分組以及給藥 將體重在200～240 g的雄性SD大鼠，隨機分為正常組和MCAO/R模型組，每組6只。正常組和MCAO/R組大鼠實驗前禁食12 h，自由飲水，正常組以1 mL/100 g體積給予4-HBd（灌胃：400 mg/kg）;模型組進行MCAO/R手術(shù)，于再灌注2 h后以1 mL/100g體積給予4-HBd（灌胃：400mg/kg）。

2.5 氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的測定

2.5.1 色譜條件 色譜柱：Eclipse AAA（4.6×150mm 3.5um，美國Agilent公司）;流動相：流動相B為緩沖液：甲醇：四氫呋喃（V：V：V）=800：190：10;流動相C為緩沖液：甲醇（V：V）=240：760，抽濾超聲后用。緩沖液為20mM乙酸鈉溶液（PH7.2）。檢測波長：激發(fā)波長：340nm，發(fā)射波長：455nm;流速：0.8mL/min;柱溫：40℃，進樣量：5μL。梯度洗脫程序見表1。

2.5.2 衍生液的配置 精密稱取OPA25mg，加入0.5mL甲醇溶解，再加入40μL 2-巰基乙醇、5mL 0.4mol·L-1硼酸-氫氧化鈉緩沖液（pH=9.6），避光，0℃～4℃保存。隔日補加10～15μL。

2.5.3 氨基酸衍生進樣程序 從樣品中抽取5μL：從樣品瓶2（超純水，洗針）抽取0μL;從樣品瓶1（衍生液）抽取2.5μL：將7.5μL混合到空氣中，最大速度，6次，等待0.5min;從樣品瓶2（超純水，洗針）抽取0μL;進樣5μL。

2.6 數(shù)據(jù)處理 實驗數(shù)據(jù)均以（x±s）表示，采用GraphPad prism5.0 軟件進行統(tǒng)計，組間比較采用單因素方差分析法處理，方差齊者采用LSD 法檢驗，方差不齊者采用Tamhanes 法檢驗。

3 實驗結(jié)果

3.1 HPLC-FLD檢測條件的考察 在建立的HPLC-FLD檢測色譜條件下，腦透析樣品中四種氨基酸分離較好，峰形良好，表明此方法具備良好的專屬性，HPLC色譜結(jié)果見圖1。以峰面積積分值（A）為縱坐標Y，以濃度（C）為橫坐標X，繪制標準曲線并求得回歸方程。結(jié)果表明，Asp、Glu、Gly和GABA對照品濃度在范圍內(nèi)與其峰面積呈良好的線性關(guān)系，結(jié)果見表2。

3.2 4-HBd對MCAO/R模型大鼠腦透析液中Glu動態(tài)變化的影響 與假手術(shù)組相比，MCAO/R模型組大鼠腦透析液中 Glu釋放水平升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05，P<0.01）;與模型組相比，4-HBd可明顯下調(diào)模型大鼠腦透析液中0.25h～6h、10h～24h Glu的釋放水平，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05，P<0.01），結(jié)果見圖2。

3.3 4-HBd對MCAO/R模型大鼠腦透析液中Asp動態(tài)變化的影響 結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，MCAO/R模型組大鼠腦透析液中各時間點Asp釋放水平均無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義;與模型組相比，4-HBd對模型大鼠腦透析液中各時間點Asp的釋放水平無明顯影響，差異無統(tǒng)計學意義，結(jié)果見圖3。

3.4 4-HBd對MCAO/R模型大鼠腦透析液中Gly動態(tài)變化的影響 結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，MCAO/R模型大鼠腦透析液中18h Gly水平升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），其余各時間點均無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義;與模型組相比，4-HBd可明顯上調(diào)模型大鼠腦透析液中0.25、1.25、2.5、14、18、20h時間點Gly的釋放水平，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01），無濃度-時間關(guān)系，結(jié)果見圖4。

3.5 4-HBd對MCAO/R模型大鼠腦透析液中GABA動態(tài)變化的影響 結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，MCAO/R模型組大鼠腦透析液中各時間點GABA釋放水平均無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義;與模型組相比，4-HBd可明顯上調(diào)模型大鼠腦透析液中0.75、1.25、2.5h時間點GABA的釋放水平，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01），無濃度-時間關(guān)系，結(jié)果見圖5。

4 討論

微透析技術(shù)具有實時、原位、自動篩選游離態(tài)藥物，樣品分析無需前處理等優(yōu)點。并且腦微透析液相比傳統(tǒng)的腦組織勻漿液，能更加準確、真實的反映特定腦區(qū)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放情況。本研究利用微透析在非麻醉的MCAO/R模型動物上取樣，能較真實地反應(yīng)IS病理狀態(tài)下腦內(nèi)氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)含量的動態(tài)變化[7]，以探討4-HBd抗神經(jīng)細胞凋亡的可能機制。研究結(jié)果顯示MCAO/R模型組大鼠腦透析液中Glu含量明顯升高，4-HBd可明顯下調(diào)MCAO/R模型大鼠皮層區(qū)0.25h～6h、10h～24h腦透析液中EAA類Glu的含量，但對Asp含量無明顯影響。

在IS病理過程中，缺血缺氧環(huán)境引起突觸后神經(jīng)元去極化，釋放大量EAA，而其重攝取功能受到抑制，使細胞外EAA大量堆積，EAA主要包括Glu和Asp。 EAA的神經(jīng)毒性主要表現(xiàn)為：大量K+外流，Na+內(nèi)流，Cl-及H2O被動內(nèi)流引起以神經(jīng)元滲透性水腫為主的急性損傷，誘導(dǎo)神經(jīng)細胞的凋亡或壞死;另外，EAA通過刺激EAA受體，啟動Ca2+通道，Ca2+大量內(nèi)流，激活一系列依賴于Ca2+的酶系統(tǒng)，造成遲發(fā)性神經(jīng)元變性壞死。作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的IAA，主要包括GABA和甘氨酸Gly，可通過突觸后膜超極化、減少離子內(nèi)流、降低細胞代謝及氧消耗，使突觸后神經(jīng)元處于保護性抑制狀態(tài)，抑制神經(jīng)元興奮，減輕細胞損傷[8-11]。IAA雖能對抗EAA毒性，但腦缺血后IAA代償過度釋放，會出現(xiàn)IAA耗竭現(xiàn)象，致使原發(fā)性抑制降低，因此IAA在IS時過度釋放一直是研究者們存有爭議的問題[12-13]。在本研究的實驗條件下，MCAO/R模型組大鼠在再灌注24h 內(nèi)腦透析液中IAA類GABA和Gly的釋放水平?jīng)]有觀察到明顯變化。

IS時細胞外液中Glu的大量堆積是神經(jīng)興奮性毒性的源頭，是引起神經(jīng)元滲透性水腫、遲發(fā)性神經(jīng)元變性壞死、神經(jīng)元凋亡等一系列神經(jīng)損傷[14-15]的重要因素。為此，4-HBd的抗神經(jīng)細胞凋亡的作用可能與降低EAA類神經(jīng)遞質(zhì)Glu含量有關(guān)。

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（收稿日期：2020-05-04）