龔菊梅，胡曉妹，何曉麗，劉修樹， 方麗波，范高福，沈 慧，范雪梅

(1.合肥職業(yè)技術(shù)學(xué)院，安徽 合肥 230038; 2.福建省莆田市中醫(yī)醫(yī)院，福建 莆田 351100；3.清華大學(xué) 化學(xué)系，北京 100084)

本品為忍冬科植物忍冬(LonicerajaponicaThunb.) 的干燥花蕾或帶初開的花。研究表明，不同產(chǎn)地、不同品種金銀花藥材化學(xué)品質(zhì)差異較大。用于癰腫疔瘡，喉痹，丹毒，熱毒血痢，風(fēng)熱感冒，溫病發(fā)熱[1]。功效方面具有抑菌[2]、抗病毒[3-4]、解熱抗炎[5-6]、保肝、止血、抗氧化[7]、免疫調(diào)節(jié)[8]等作用。目前《中國(guó)藥典》規(guī)定了金銀花的質(zhì)量測(cè)定的成分有綠原酸和木犀草苷。綠原酸作為金銀花含量最豐富的咖啡?；鼘幩犷惓煞?，其含量常用來作為控制金銀花的質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)[9-10]。

由于金銀花是作為清開靈注射液的原料之一，在清開靈注射液中不含木犀草苷，因此，只考察了咖啡酰基奎寧酸類綠原酸、新綠原酸和異綠原酸含量。本實(shí)驗(yàn)采用一評(píng)多測(cè)法，以綠原酸為內(nèi)標(biāo)，建立新綠原酸和異綠原酸的校正因子，通過高效液相色譜法對(duì)9批金銀花藥材中綠原酸、新綠原酸和異綠原酸含量測(cè)定方法進(jìn)行研究，為金銀花及其產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 儀器 SHIMADZU LC-2010A型高效液相色譜儀(帶有SPD-M10A型二極管陣列檢測(cè)器，自動(dòng)進(jìn)樣器)(日本島津儀器公司)；Milli-Q超純水純化系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)；KQ-250B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；XP250分析天平(梅特勒-托利多公司)；101-1AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司)。

1.1.2 試劑 乙腈、甲醇(DIKMA和FISHER公司，色譜純);甲酸(北京第二化工廠，分析純);超純水(自制)；綠原酸(中國(guó)藥品生物制品檢定所 批號(hào)：120712，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.3%);金銀花藥材(明興藥業(yè)有限公司提供，產(chǎn)自河南封丘)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 色譜柱選用Phenomenex Luna C18分析柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流動(dòng)相：A 0.1%甲酸-水，B 乙腈；梯度洗脫如下：0～3 min, 5%B; 3～13 min, 5%～15%B;13～15 min,15%B; 15～50 min，15%～30%B。流速：0.5 mL/min；柱溫：25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：240 nm。

1.2.2 供試品溶液的制備 將金銀花藥材粉碎，取本品粉末(過三號(hào)篩)約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入15 mL的純水，超聲處理30 min，搖勻、濾過，取續(xù)濾液，過0.45 μm濾膜，即得。

1.2.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取綠原酸對(duì)照品15.65 mg，置于25 mL容量瓶中，用純化水定容，作為母液，將綠原酸對(duì)照品母液分別稀釋2、4、5、10、20倍，過0.45 μm濾膜，即得。

1.2.4 線性關(guān)系的考察 精密量取“1.2.3”節(jié)下的對(duì)照品溶液，分別過0.45 μm微孔濾膜，進(jìn)樣20 μL，記錄峰面積，以平均峰面積值(Y)對(duì)濃度(X)進(jìn)行線性回歸，得到綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 取“線性關(guān)系考察”節(jié)下的對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，記錄峰面積和保留時(shí)間，計(jì)算RSD值。

1.2.6 精密度考察 取金銀花藥材，精密稱定，按供試品溶液制備方法制備供試品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣20 μL，記錄綠原酸、新綠原酸和異綠原酸峰的峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(Sr)值。

1.2.7 重復(fù)性考察 取金銀花藥材，精密稱定，按供試品溶液制備方法平行制備樣品供試液6份，每份樣品進(jìn)樣20 μL，記錄綠原酸、新綠原酸和異綠原酸峰的峰面積，計(jì)算RSD值。

1.2.8 穩(wěn)定性考察 取金銀花藥材，精密稱定，按供試品溶液制備方法制備樣品供試液，分別于0、2、4、8、24、48 h進(jìn)樣，記錄綠原酸、新綠原酸和異綠原酸峰的峰面積，計(jì)算RSD值。

1.2.9 加樣回收率 取金銀花藥材，精密稱定，按供試品溶液制備方法平行制備樣品供試液6份，每份樣品進(jìn)樣20 μL，記錄綠原酸、新綠原酸和異綠原酸峰的峰面積，計(jì)算加樣回收率。

1.2.10 含量測(cè)定 將9批金銀花藥材按照“1.2.2”項(xiàng)下制備成供試品溶液后，進(jìn)樣20 μL，得到峰面積，計(jì)算含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系的考察

綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線圖如圖1所示?；貧w方程為y=67688483.018x-592968.725，r值為0.9993，綠原酸在0.013～0.526 mg/mL的濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，測(cè)得異綠原酸和新綠原酸的相對(duì)校正因子分別為1.027和1.018。

圖1 綠原酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

通過綠原酸對(duì)照品五次進(jìn)樣后紀(jì)律的保留時(shí)間和峰面積，計(jì)算得到的綠原酸保留時(shí)間和峰面積的RSD值為0.43%、1.47%，均符合要求，說明該方法下的儀器系統(tǒng)適應(yīng)性良好。

2.3 精密度考察

通過精密度計(jì)算結(jié)果可知，綠原酸積分平均值為8 324 466、RSD為2.34%，新綠原酸峰面積積分平均值為3 307 110、RSD為4.08%，異綠原酸峰面積積分平均值為762 902、RSD為2.88%。結(jié)果顯示，金銀花藥材中綠原酸、新綠原酸和異綠原酸峰面積的RSD均小于5%，表明儀器精密度良好。

2.4 重復(fù)性考察

通過重復(fù)性計(jì)算結(jié)果可知，綠原酸積分平均值為8 324 466、RSD為2.34%，新綠原酸峰面積積分平均值為3 307 110、RSD為4.08%，異綠原酸峰面積積分平均值為769 524、RSD為2.78%。結(jié)果顯示，金銀花藥材中綠原酸、新綠原酸和異綠原酸的RSD均小于5%，表明該測(cè)定方法的重復(fù)性較好。

2.5 穩(wěn)定性考察

通過穩(wěn)定性計(jì)算結(jié)果可知，綠原酸積分平均值為8 325 305、RSD為2.22%，新綠原酸峰面積積分平均值為3 367 522、RSD為3.72%，異綠原酸峰面積積分平均值為777 860、RSD為2.74%。結(jié)果顯示，金銀花中綠原酸、新綠原酸和異綠原酸的RSD均小于5%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.6 加樣回收率

加樣回收率結(jié)果如表1所示，金銀花藥材中綠原酸、新綠原酸和異綠原酸加樣回收率分別為99.53%、99.73%、100.23%，RSD分別為4.27%、2.49%、1.58%，均小于5%，表明該測(cè)定方法的符合金銀花定量分析要求。

表1 金銀花藥材中綠原酸、新綠原酸和異綠原酸加樣回收結(jié)果

2.7 含量測(cè)定

由表2和圖2可知，9批次金銀花藥材含量變化較大，綠原酸含量測(cè)定范圍為1.538%～2.147%。其RSD大于5%。其測(cè)定樣品HPLC圖譜詳見圖3。

表2 9批金銀花藥材含量測(cè)定結(jié)果

圖2 9批金銀花藥材含量柱狀圖

1：綠原酸；2異綠原酸；3新綠原酸

3 結(jié)論與討論

新綠原酸與異綠原酸為綠原酸的同分異構(gòu)體，均為單咖啡?；鼘幩?，差別僅在于咖啡?；c奎寧酸連接位置不同，從紫外吸收光譜來看，在清開靈成品中綠原酸、新綠原酸和異綠原酸的紫外吸收波長(zhǎng)分別為232、242、235 nm。故本研究采用240 nm波長(zhǎng)作為清開靈成品中三種成分的檢測(cè)波長(zhǎng)。

金銀花作為清開靈注射液組方藥材之一，其成分綠原酸、新綠原酸和異綠原酸含量的高低可作為表征清開靈質(zhì)量好壞的標(biāo)準(zhǔn)之一。由含量測(cè)定結(jié)果來看，9批明興藥業(yè)提供的金銀花中綠原酸、新綠原酸和異綠原酸的含量變化較大，RSD大于5%。說明不同批次的金銀花對(duì)于清開靈的療效有影響，因而需要更深層次探索研究，以確保清開靈注射液的質(zhì)量。