廖慧琦，呂春霞，陸益鋇，胡遠(yuǎn)輝，雷葉斯，張慧恩，楊華

(浙江萬里學(xué)院，浙江 寧波，315100)

大黃魚又名黃花魚，其味道鮮美，營養(yǎng)豐富，深受國內(nèi)外消費(fèi)者的青睞[1]。大黃魚蛋白質(zhì)豐富，是理想的動物蛋白來源，同時含有許多微量元素，能夠清除人體代謝產(chǎn)生的自由基，有延緩機(jī)體衰老，提高免疫力等多種功效[2-4]。但是因為野生大黃魚產(chǎn)量低且價格昂貴，故上世紀(jì)80年代中后期開始研究大黃魚的人工養(yǎng)殖，養(yǎng)殖大黃魚的產(chǎn)量迅速上升[5-6]。隨著產(chǎn)量的增加，如何深度發(fā)掘利用資源，提高經(jīng)濟(jì)利用價值成為亟待解決的問題。目前養(yǎng)殖大黃魚仍以初級加工制品等為主，精加工及高附加值產(chǎn)品仍然較少[7]。因此，需要一種更好的加工方式來提高養(yǎng)殖大黃魚產(chǎn)品的附加值，這對養(yǎng)殖大黃魚產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重大意義。

魚糜制品因具有高蛋白、低脂肪等特點深受消費(fèi)者的喜愛，在魚肉制品中占有很大比例[8]。據(jù)了解目前市場上的魚糜制品幾乎都是由低值魚加工而成，不過隨著人們對食品的營養(yǎng)需求提高，某些高檔魚類也用于加工魚糜制品，例如帶魚魚糜制品[9]。大黃魚肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)豐富，研究開發(fā)大黃魚魚糜制品可以提升大黃魚價值，豐富魚糜制品的種類，擴(kuò)大市場。魚糜的凝膠特性是評價魚糜品質(zhì)的重要指標(biāo)，所以有效改善魚糜凝膠特性是目前魚糜加工的一個焦點問題。

肌原纖維蛋白是形成凝膠最重要的蛋白質(zhì)，屬于鹽溶性蛋白質(zhì)，主要包括肌球蛋白、肌動蛋白、原肌球蛋白和肌原蛋白等。肌原纖維蛋白與肉制品的黏附性、保水性、彈性、質(zhì)地等密切相關(guān)，很大程度上能影響魚糜凝膠特性[10]。在蛋白質(zhì)凝膠化過程中都會先加食鹽斬拌，其目的是使肌原纖維蛋白充分溶解，進(jìn)而螺旋結(jié)構(gòu)展開，氨基酸殘基充分暴露，呈溶膠狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)在肌原纖維蛋白中添加NaCl可引起膨脹斷裂，使蛋白的持水性增強(qiáng)，黏度增大[11]。劉茹等[12]研究發(fā)現(xiàn)，添加2.15%～3%的NaCl后，肉糜的凝膠特性較好，且隨著NaCl添加量的增加，肉糜的凝膠特性有所提高。根據(jù)研究分析可以看出添加NaCl不僅可以改善魚糜的風(fēng)味，還可以促進(jìn)魚糜凝膠特性。故研究不同NaCl添加量對肌原纖維蛋白凝膠特性的影響對后期改善魚糜凝膠品質(zhì)及生產(chǎn)高質(zhì)量魚糜制品具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

養(yǎng)殖大黃魚，體質(zhì)量為(0.5±0.1) kg，冰盒保鮮運(yùn)回實驗室，購于寧波路林市場；NaCl、無水乙醇、叔丁醇、Na2HPO4、NaH2PO4均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Bradford法蛋白濃度測定試劑盒，Solarbio有限公司；戊二醛(分析純)，麥克林試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TA-XT Plus 物性分析儀，美國FTC公司；XW-80A 漩渦混勻器，西寶生物科技有限公司；ALPHA2-4冷凍干燥儀，上海繼譜電子科技有限公司；FC 型酶標(biāo)儀，上海維城儀器有限公司；In Via-Reflex 拉曼光譜儀，法國Renishaw公司；S-4800 場發(fā)射掃描電子顯微鏡，日本日立公司；色差計，上海源琦檢測儀器有限公司；恒溫水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 原料預(yù)處理

養(yǎng)殖大黃魚去頭、去尾、去鱗、去內(nèi)臟等，淋洗干凈，瀝干取肉，-20 ℃冰箱保存待用。

1.3.2 肌原纖維蛋白的提取

參照CHIN等[13]和JIANG等[14]的方法稍作修改，取適量魚糜，加入4倍體積冰提取液(20 mmol/L，pH 7.5磷酸鹽緩沖液)，高速勻漿機(jī)均漿60 s(7 500 r/min)，將所得的勻漿液冷凍離心10 min(7 000 r/min，4 ℃)，除去上清液，重復(fù)3次，得到粗肌原纖維蛋白。再加入4倍體積冰洗液(0.1 mol/L NaCl)，均漿60 s(7 500 r/min)，離心10 min，取沉淀，重復(fù)1次上述實驗，最后一次勻漿液用3層紗布過濾，以7 000 r/min冷凍離心10 min，得到的沉淀即為養(yǎng)殖大黃魚肌原纖維蛋白，-40 ℃冷凍48 h，冷凍干燥24 h，液氮研磨成粉，真空包裝，干燥保存。

1.3.3 肌原纖維蛋白濃度測定

先將Bradford工作液配制完成，然后取96孔板，將BSA標(biāo)準(zhǔn)品按不同體積依次加到孔中，補(bǔ)充稀釋液到20 μL；再在孔中加入一定體積的經(jīng)磷酸鹽緩沖溶液稀釋的肌原纖維蛋白樣品，補(bǔ)充稀釋液到20 μL；然后在各個孔中加入200 μL Bradford工作液，37 ℃恒溫?fù)u床放置15～30 min后測OD593。

1.3.4 肌原纖維蛋白凝膠制備

取離心管，加入5 g養(yǎng)殖大黃魚肌原纖維蛋白，分別添加0%、1%、2%、3%、4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的NaCl，旋渦振蕩儀均質(zhì)5 min，置于水浴鍋中，使溫度從20 ℃升到70 ℃，加熱30 min后立即取出，置于4 ℃冰箱冷藏過夜，在對肌原纖維蛋白凝膠進(jìn)行測定前要先將樣品在室溫下放置1 h[15]。

1.3.5 質(zhì)構(gòu)指標(biāo)的測定

肌原纖維蛋白凝膠在90 ℃下加熱20 min，冰水冷卻至室溫后置于質(zhì)構(gòu)儀載物臺上，采用P/25探頭，應(yīng)變力為0.1 N，測試速度為60 mm/min，形變量為50%，室溫下完成測定。

1.3.6 肌原纖維蛋白凝膠持水性的測定

肌原纖維蛋白凝膠的持水性測定參照顏偉華等[16]的方法并略做修改，取養(yǎng)殖大黃魚肌原纖維蛋白凝膠于離心管內(nèi)離心10 min(4 ℃，8 000 r/min)，按照公式(1)計算凝膠持水性(water binding capacity,WHC):

(1)

式中：W1為離心前樣品質(zhì)量；W2為離心后樣品質(zhì)量。

1.3.7 肌原纖維蛋白白度的測定

參照PARRARAVIVAT等[17]的方法并略做修改，將養(yǎng)殖大黃魚魚糜凝膠樣品切成5 mm左右的薄片，在室溫下用色差計測定樣品L*、a*、b*值，每組樣品平行測定5次，按照公式(2)計算白度值:

(2)

式中：L*值表示樣品的亮度；a*值表示樣品的紅綠值；b*表示樣品的黃藍(lán)值。每組實驗重復(fù)5次，取平均值。

1.3.8 拉曼光譜測定

養(yǎng)殖大黃魚肌原纖維蛋白凝膠樣品采用拉曼光譜分析，參考張自業(yè)[15]的方法。將制備好的肌原纖維蛋白凝膠樣品置于載玻片上，選擇50倍長聚焦鏡頭對肌原纖維蛋白樣品進(jìn)行聚焦。檢測參數(shù)為所用功率為100 mW，532 nm氬離子激光器，分辨率為1 cm-1，獲取的拉曼光譜范圍在400～4 000 cm-1。

1.3.9 凝膠微觀結(jié)構(gòu)的觀察

參照許艷順[18]的方法，并略做修改。將養(yǎng)殖大黃魚魚糜凝膠切成整齊的塊狀置于塑料培養(yǎng)皿中，加入一定量的戊二醛，于4 ℃下固定24 h，用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液漂洗3～5次，再用不同含量的乙醇及無水乙醇叔丁醇混合溶液(3∶1、1∶1、1∶3,體積比)、乙醇、叔丁醇漂洗，最后冷凍干燥，噴金，掃描觀察。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗均平行3次，數(shù)據(jù)采用Excel軟件作圖，IBM SPSS Statistics 25.0進(jìn)行單樣本T檢驗(n=3)、顯著性分析及組間相關(guān)性分析，不同小寫字母表示具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaCl添加量對肌原纖維蛋白凝膠質(zhì)構(gòu)特性的影響

質(zhì)構(gòu)是判斷魚糜品質(zhì)的主要感官指標(biāo)之一，硬度越高，膠黏性越低，彈性、咀嚼性等也會相應(yīng)地提高[18]。LAURE等[20]發(fā)現(xiàn)豬半膜肌蛋白凝膠的破裂力會隨鹽濃度增大而提高。由表1結(jié)果可知，添加了NaCl后的養(yǎng)殖大黃魚肌原纖維蛋白凝膠的膠黏性、咀嚼性都大于空白組，且在NaCl添加量為2%時達(dá)到最大值；凝膠的硬度隨NaCl添加量的增加先上升后下降，且組分之間差異顯著(P<0.05)；在NaCl添加量為0%～2%時，凝膠的黏附性隨NaCl添加量的增加而增大，在添加量為2%時黏附性達(dá)到最大值；隨著NaCl添加量的增多，內(nèi)聚性不斷增大，NaCl添加量為3%時達(dá)到最大(P<0.05)；添加不同量NaCl后養(yǎng)殖大黃魚肌原纖維蛋白凝膠的彈性顯著增大(P<0.05)，NaCl添加量為3%時凝膠彈性達(dá)到最大(P<0.05)。這些現(xiàn)象出現(xiàn)的原因可能是由于離子強(qiáng)度的升高，肌原纖維蛋白分子間的靜電斥力減弱，分子間距離縮短，蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間發(fā)生聚集，形成更好的凝膠[15]。

表1 NaCl添加量對肌原纖維蛋白凝膠質(zhì)構(gòu)特性的影響Table 1 Effect of different NaCl addition on the texture properties of myofibrillar protein gel

2.2 NaCl添加量對肌原纖維蛋白凝膠持水性的影響

持水性是肌肉受到外力作用時保持原有水分的能力。肉的持水性不僅影響肉的滋味、香氣、多汁性、嫩度、顏色等食用品質(zhì)，而且還會直接影響肉制品的成品率，故測定肌原纖維蛋白凝膠持水性對魚糜制品加工具有十分重要的意義。由圖2可知，持水性隨NaCl添加量的增加而顯著上升，在添加量為2%時達(dá)到最高，隨后開始顯著下降(P<0.05)。原因可能是由于在一定濃度的NaCl條件下，蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)細(xì)膩，孔徑小，空隙分布較均一，可以容納更多的水分[21]。研究發(fā)現(xiàn)隨著離子含量的升高，肌原纖維蛋白的溶解度增大，蛋白變性展開，形成更為致密的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，更能吸附包裹水分[15]。

圖1 NaCl添加量對肌原纖維蛋白凝膠持水性的影響Fig.1 Effect of different NaCl addition on water retention of myofibrillar protein gel注：不同小寫字母表示具有顯著性差異(P<0.05)

2.3 NaCl添加量對肌原纖維蛋白凝膠白度的影響

食品的色澤是至關(guān)重要的，因為在魚糜制作過程中的漂洗是不可缺少的，從而除去血漬、腥味物質(zhì)從而改善凝膠白度，故測定NaCl處理后的肌原纖維蛋白凝膠白度可以為后續(xù)加工魚糜提供參考。不同NaCl添加量的條件下肌原纖維蛋白凝膠白度的變化見表2。由表2可知，隨著NaCl添加量的增加，養(yǎng)殖大黃魚肌原纖維蛋白凝膠的白度值不斷升高，NaCl添加量越大，白度值升高的程度越大。

表2 NaCl添加量對肌原纖維蛋白凝膠白度的影響Table 2 Effect of different NaCl addition on the whiteness of myofibrillar protein gel

2.4 NaCl添加量對肌原纖維蛋白凝膠二級結(jié)構(gòu)的影響

拉曼光譜是一種能快速無損檢測蛋白質(zhì)肽鏈變化的分析技術(shù)，通過拉曼光譜分析可以測定蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的變化及對共價鍵和非共價鍵的影響。由圖2可知，空白組的峰值最大，NaCl添加量為4%的峰值次之，在NaCl添加量1%～3%時，隨著NaCl添加量的增加，峰值降低。拉曼光譜的酰胺Ⅲ帶的峰在1 250 cm-1附近，酰胺 Ⅰ 帶的峰在1 650 cm-1附近，結(jié)合酰胺Ⅲ帶、酰胺 Ⅰ 帶可以分析出肌原纖維蛋白凝膠二級結(jié)構(gòu)變化。在1 650～1 670 cm-1處，當(dāng)α-螺旋轉(zhuǎn)變成β-折疊或無規(guī)則卷曲時，譜帶發(fā)生右移[22]。同時拉曼光譜中在515～550 cm-1還可以表示二硫鍵構(gòu)象的變化[23-24]。分析發(fā)現(xiàn)添加NaCl之后肌原纖維蛋白凝膠的α-螺旋減少，β-折疊或者無規(guī)則卷曲增加，β-折疊結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)集聚和形成良好凝膠的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)，增加魚糜體系中β-折疊的含量，有助于改善魚糜制品的質(zhì)構(gòu)特性和保水性。

圖2 NaCl添加量對肌原纖維蛋白凝膠拉曼光譜的影響Fig.2 Effect of different NaCl addition on Raman spectroscopy of myofibrillar protein gel

2.5 NaCl添加量對肌原纖維蛋白凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響

由圖3可以看出，空白組和NaCl添加量組的微觀結(jié)構(gòu)具有明顯的不同，空白組的凝膠結(jié)構(gòu)斷裂嚴(yán)重，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)不連續(xù)，凝膠空隙的形狀不規(guī)則。NaCl添加量為1%組的凝膠結(jié)構(gòu)開始趨于連續(xù)，孔洞逐漸規(guī)則均勻，交聯(lián)度增高，這可能是因為蛋白之間由于疏水、靜電及氫鍵相互作用的改變，導(dǎo)致其發(fā)生聚集和交聯(lián)，蛋白質(zhì)開始出現(xiàn)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。在NaCl添加量為2%～4%時，蛋白凝膠結(jié)構(gòu)越來越均勻致密，且孔洞數(shù)量明顯減少，交聯(lián)度高，這一現(xiàn)象與其凝膠的質(zhì)構(gòu)特性、白度的結(jié)果一致。

a-空白組 b-1%NaCl;c-2%NaCl;d-3%NaCl;e-4%NaCl圖3 NaCl添加量對肌原纖維蛋白凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響Fig.3 Effect of different NaCl addition on the microstructure of myofibrillar protein gel

2.6 魚糜凝膠與肌原纖維蛋白凝膠的相關(guān)性分析

將添加NaCl后的養(yǎng)殖大黃魚魚糜凝膠與肌原纖維蛋白凝膠的硬度、黏附性、內(nèi)聚性、彈性、膠黏性、咀嚼性、持水性的參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如表3所示。由表3結(jié)果可以看出魚糜凝膠與肌原纖維蛋白凝膠具有一定的相關(guān)性，運(yùn)用皮爾森相關(guān)性分析肌原纖維蛋白凝膠與魚糜凝膠的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)魚糜凝膠的硬度、膠黏性與肌原纖維蛋白凝膠的硬度、膠黏性具有很強(qiáng)的相關(guān)性；兩個體系之間的黏附性、內(nèi)聚性、彈性、咀嚼性具有中度相關(guān)性；而二者之間的白度、持水性具有低度相關(guān)性。通過分析發(fā)現(xiàn)，NaCl可以通過促進(jìn)肌原纖維蛋白形成凝膠，從而進(jìn)一步改善魚糜凝膠特性。

表3 魚糜凝膠與肌原纖維蛋白凝膠的皮爾森相關(guān)性檢驗Table 3 Pearson correlation test of surimi gel and myofibrillar protein gel

3 討論

為了提高魚糜制品的風(fēng)味、口感及凝膠特性，在魚糜制品生產(chǎn)過程中，經(jīng)常會選擇添加一些外源添加劑[25-26]。蔣欣靜等[27]研究發(fā)現(xiàn)添加大豆胰蛋白酶制劑對鰱魚肌肉中的肌原纖維蛋白降解有抑制作用。CAMPO-DEAO等[28]將蛋清蛋白加入到用來制作模擬蟹棒的阿拉斯加鱈魚糜和太平洋牙鱈魚糜中，發(fā)現(xiàn)成品均具有較好的黏彈性，同時提高了魚糜的蛋白含量。相關(guān)資料顯示在魚糜的生產(chǎn)加工中也常會添加一些NaCl，既可以調(diào)節(jié)魚糜制品的味道，還可以提高魚糜制品的凝膠特性[29]。實驗結(jié)果表明，NaCl對養(yǎng)殖大黃魚魚糜肌原纖維蛋白凝膠特性具有顯著性影響，添加NaCl后，肌原纖維蛋白凝膠質(zhì)構(gòu)特性、凝膠強(qiáng)度、持水性、白度等都有明顯增強(qiáng)，同時肌原纖維蛋白凝膠的二級結(jié)構(gòu)也發(fā)生明顯變化。通過電鏡掃描觀察，發(fā)現(xiàn)添加NaCl后，肌原纖維蛋白凝膠的微觀結(jié)構(gòu)結(jié)合更加緊密。進(jìn)一步通過皮爾森相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)添加不同量的NaCl后肌原纖維蛋白凝膠特性與魚糜凝膠特性具有一定的相關(guān)性。

綜上所述，在魚糜的生產(chǎn)加工過程中添加NaCl可以改善肌原纖維蛋白凝膠特性，進(jìn)而改善魚糜的品質(zhì)，并為后續(xù)生產(chǎn)加工高品質(zhì)魚糜提供了思路。值得注意的是魚糜凝膠特性的影響因素還有很多，今后仍需進(jìn)一步研究。而且人們對食品的要求不僅包含美味，更要注重健康，因此在保證魚糜制品品質(zhì)的同時，仍應(yīng)該控制NaCl的添加量，提高魚糜制品的安全性。