曾靜霞，周 維，姜彧騰，薛春玲*

（1南京醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院急診/重癥醫(yī)學(xué)科，南京210008；2南京醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院兒科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210008）

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是以系統(tǒng)生物學(xué)為理論基礎(chǔ)，通過(guò)高通量組學(xué)數(shù)據(jù)分析、計(jì)算機(jī)虛擬計(jì)算及網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，對(duì)生物系統(tǒng)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，從整體上預(yù)測(cè)藥物靶點(diǎn)、提高藥物發(fā)現(xiàn)效率的新興學(xué)科，具有整體性、系統(tǒng)性等特點(diǎn)，已廣泛用于篩選藥物活性成分、闡釋藥物作用機(jī)制、研究疾病發(fā)病機(jī)制等方面［1-2］。分子對(duì)接技術(shù)是通過(guò)受體或蛋白的特征及受體與藥物分子之間的相互作用方式來(lái)預(yù)測(cè)其結(jié)合模式和親合力的一種理論模擬方法。

抗601合劑（Anti-601 Mixture）是由南京市兒童醫(yī)院根據(jù)兒童特點(diǎn)研制的經(jīng)江蘇省藥監(jiān)局批準(zhǔn)（蘇藥制字Z04000304）使用的自制中藥復(fù)方制劑，由黃芪、黃柏、大黃、板藍(lán)根、金銀花五味藥組成?？?01合劑具有清熱解毒、抗病毒、抗炎作用，由于療效確切、價(jià)格低，在兒童中使用廣泛，臨床廣泛用于病毒性肺炎、急性上呼吸道感染、急性支氣管炎、扁桃體炎、腮腺炎等疾病，可改善患者的發(fā)熱、咳嗽等呼吸道癥狀，臨床應(yīng)用效果良好。本研究擬通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)研究抗601合劑抗病毒、抗炎的潛在作用機(jī)制，為藥物更廣泛應(yīng)用于臨床提供有力的科學(xué)依據(jù)。

1 方法

1.1 抗601合劑中成分搜集

采用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）［3］（http：//tcmspw.com/tcmsp.php），選擇“Herb name”，分別輸入“黃芪”“黃柏”“大黃”“板藍(lán)根”“金銀花”關(guān)鍵詞，檢索獲得抗601合劑中各味藥材所含的化學(xué)成分。

1.2 活性化合物及靶標(biāo)蛋白的篩選

口服生物利用度（oral bioavailability，OB）指口服藥物的有效成分或活性基被胃腸道吸收，經(jīng)肝腎代謝，到達(dá)體循環(huán)并被吸收的速度與程度，是藥物吸收、分布、代謝、排泄中最重要的參數(shù)之一，是評(píng)價(jià)藥物藥效的重要指標(biāo)。藥物的口服生物利用度低不僅導(dǎo)致個(gè)體間和個(gè)體內(nèi)差異、血藥濃度波動(dòng)大，同時(shí)增加生產(chǎn)成本，增大機(jī)體毒性。從生物學(xué)角度看，類(lèi)藥性（drug-likeness，DL）是藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)和安全性的總和，對(duì)于判斷中藥成分是否可對(duì)機(jī)體產(chǎn)生活性具有重要參考價(jià)值。因抗601合劑為口服制劑，在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中用OB≥30%和DL≥0.18篩選抗601合劑的活性成分，并利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)功能收集抗601合劑中化學(xué)成分的靶標(biāo)蛋白，利用UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.uniprot.org/），限定物種為人，檢索得到所有靶標(biāo)蛋白所對(duì)應(yīng)的基因。

1.3 藥材－化合物－靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

先將化合物對(duì)應(yīng)的基因帶入蛋白質(zhì)相互作用分析平臺(tái) STRING（https：//string-db.org/），獲取蛋白相互作用的關(guān)系。再將抗601合劑中藥材成分、化合物、靶點(diǎn)（基因）導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件（https：//cytoscape.org/）構(gòu)建“藥材－化合物－靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，設(shè)置節(jié)點(diǎn)連接度（degree）大于所有節(jié)點(diǎn)連接度中位數(shù)的2倍為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，確定關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。

1.4 靶點(diǎn)通路分析

將所有化合物靶基因?qū)氲絎ebGestalt在線軟件（http：//webgestalt.org/）中進(jìn)行生物學(xué)過(guò)程和信號(hào)通路富集分析。進(jìn)行WebGestalt的基本參數(shù)選擇，Organism of Interest選擇對(duì)應(yīng)的物種“Homo Sapiens”，Method of Interest選擇“ORA”，F(xiàn)untional Database分 別 選 擇“network+miRNA target”及“passway+KEGG”，點(diǎn)擊“submit”獲得通路富集結(jié)果。

1.5 成分－靶點(diǎn)分子對(duì)接

先從 RSCB PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.rcsb.org/）下載前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶2（prostaglandin-endoperoxidase synthase 2，PTGS2）的 3D 結(jié)構(gòu)pdb格式文件，運(yùn)用Discovery Studio 4.5 Client軟件去除PTGS2中的配體和水分子，再保存為pdb格式文件。從PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載活性化合物2D結(jié)構(gòu)的SDF格式文件。利用PyRx軟件進(jìn)行分子對(duì)接，先上傳去水加氫后的PTGS2受體文件，將其轉(zhuǎn)化為pdbqt格式文件，再分別上傳配體化合物文件，將其能量最小化，并轉(zhuǎn)化為pdbqt格式文件，運(yùn)用Vina進(jìn)行對(duì)接［4］。結(jié)合能小于0說(shuō)明配體與受體可以自發(fā)結(jié)合，選擇結(jié)合能MODE、RSMD lower/upper bound為0的結(jié)合能為最佳結(jié)合能，表示構(gòu)象穩(wěn)定，發(fā)揮作用的可能性越大。最后運(yùn)用Discovery Studio 4.5 Client軟件進(jìn)行結(jié)果分析，輸出對(duì)接的png格式文件。

2 結(jié) 果

2.1 活性化合物的篩選

通過(guò)TCMSP檢索到黃芪、黃柏、大黃、板藍(lán)根、金銀花中化合物共724個(gè)，其中87個(gè)來(lái)自黃芪，140個(gè)來(lái)自黃柏，92個(gè)來(lái)自大黃，169個(gè)來(lái)自板藍(lán)根，236個(gè)來(lái)自金銀花。以O(shè)B≥30%且DL≥0.18，剔除缺少靶點(diǎn)預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)的化合物，篩選出活性化合物151個(gè)，其中36個(gè)來(lái)自黃芪，37個(gè)來(lái)自黃柏，16個(gè)來(lái)自大黃，39個(gè)來(lái)自板藍(lán)根，23個(gè)來(lái)自金銀花。

2.2 藥材－化合物－靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

STRING分析平臺(tái)得出抗601合劑蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction network，PPI）（圖1）?！八幉模衔铮悬c(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)總共包括312個(gè)節(jié)點(diǎn)（5個(gè)藥材節(jié)點(diǎn)，100個(gè)化合物節(jié)點(diǎn)、207個(gè)靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)）和1 478條邊，其中淡藍(lán)色圓形代表藥材，六邊形代表共有化合物，八邊形代表化合物，菱形代表靶點(diǎn)，虛線代表三者之間的相互作用，節(jié)點(diǎn)的大小與節(jié)點(diǎn)連接度呈正比關(guān)系（圖2）。從圖中可看出抗601合劑中存在單個(gè)化合物與多靶點(diǎn)作用，不同化合物共同作用于同一靶點(diǎn)的現(xiàn)象，體現(xiàn)了中藥制劑多成分與多靶點(diǎn)協(xié)同作用的機(jī)制。本研究中，按連接度大于等于所有節(jié)點(diǎn)連接度中位數(shù)的2倍為篩選標(biāo)準(zhǔn)，篩選得到藥材2個(gè)，成分46個(gè)，靶點(diǎn)81個(gè)。排名前10位的化合物分別是槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇、山柰酚、木犀草素、刺槐黃素、漢黃芩素、黃芩素、異紫堇杷明和四氫小檗堿，其節(jié)點(diǎn)連接度分別為 252、140、96、52、51、40、38、30、25、23；排名前20位的靶點(diǎn)分別是PTGS2、PTGS1、NCOA2、SCN5A、AR、PRSS1、NOS2、ADRB2、RXRA、 ESR1、 KCNH2、 GABRA1、 ADRA1B、NCOA1、PGR、CHRM1、F7、CHRM3、CHEK1、PDE3A，節(jié)點(diǎn)連接度分別為91、75、57、48、42、36、36、33、32、28、27、24、23、22、22、20、18、18、17、17，為該網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。

2.3 抗601合劑中交集化合物

從藥材－化合物－靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)得出，抗601合劑不同的藥材里面存在相同的化合物，通過(guò)在線韋恩圖［5］（圖3）可知，β-谷甾醇為黃芪、黃柏、大黃、板藍(lán)根、金銀花所共有；豆甾醇為黃芪、黃柏、板藍(lán)根、金銀花共有；黃連堿為黃芪、黃柏共有；刺槐黃素及谷甾醇為黃芪、板藍(lán)根共有；黃烷酮為黃芪、金銀花共有；檞皮素為黃柏、金銀花共有；poriferast-5-en-3beta-ol為黃柏、板藍(lán)根共有。

2.4 靶點(diǎn)通路分析

功能富集分析得到GO條目717個(gè)（P≤0.05），其中生物過(guò)程（BP）條目240個(gè)，細(xì)胞組成（CC）條目240個(gè)，分子功能（MF）條目237個(gè)。結(jié)果見(jiàn)圖4。

KEGG通路富集分析得到209條信號(hào)通路（P≤0.05），排名前10位的通路包括糖尿病并發(fā)癥相關(guān)的晚期糖基化終產(chǎn)物及其受體（advanced glycation end products and its receptor，AGE-RAGE）信號(hào)通路，IL-17信號(hào)通路，腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號(hào)通路，鉑耐藥相關(guān)通路，以及前列腺癌、胰腺癌、乙型肝炎病毒感染、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、人巨細(xì)胞病毒（HCMV）感染等疾病相關(guān)通路（圖5）。其中抗病毒相關(guān)通路涉及乙型肝炎病毒、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒、人巨細(xì)胞病毒、EB病毒和甲型流感病毒，涉及相關(guān)靶點(diǎn)基因及按照度排序依次為PTGS2、CASP3、BCL2、BAX、JUN、CASP8、CASP9、RELA、GSK3B、TP53、TNF、MAPK14、PRKCA、AKT1、CDKN1A；抗炎通路涉及AGE-RAGE信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路和TNF信號(hào)通路，其相關(guān)靶點(diǎn)基因及按照度排序依次為PTGS2、CASP3、JUN、CASP8、RELA、GSK3B、TNF、MAPK14、AKT1。

2.5 抗601合劑核心化合物作用于PTGS2的分子對(duì)接

Figure 1 Protein interaction network of Anti-601 Mixture

分子對(duì)接結(jié)果顯示，將抗601合劑在藥材－化合物－靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中連接度超過(guò)中位數(shù)兩倍的10個(gè)核心活性化合物與PTGS2進(jìn)行分子對(duì)接，與PTGS2結(jié)合能最低的化合物分別為豆甾醇（結(jié)合能為-40.6 kJ/mol）、槲皮素（結(jié)合能為-38.9 kJ/mol）、木犀草素（結(jié)合能為-38.5 kJ/mol）、刺槐黃素（結(jié)合能為-38.1 kJ/mol）、β-谷甾醇（結(jié)合能為-36.8 kJ/mol）、山柰酚（結(jié)合能為-36.8 kJ/mol）、黃芩素（結(jié)合能為-36.4 kJ/mol）、四氫小檗堿（結(jié)合能為-35.6 kJ/mol）、異紫堇杷明（結(jié)合能為-35.1 kJ/mol）、漢黃芩素（結(jié)合能為-33.5 kJ/mol）。各化合物按照結(jié)合能排序前5名的分子對(duì)接模式見(jiàn)圖6（受體中心不同顏色的小分子代表配體化合物，虛線代表氫鍵）。

3 討 論

抗601合劑臨床療效好，其中黃芩、金銀花二者配伍是抗病毒藥物的重要組成部分［6］，出現(xiàn)在2020年2月國(guó)家衛(wèi)健委頒布的新型冠狀病毒肺炎專家共識(shí)中［7］，對(duì)于抗擊新型冠狀病毒肺炎起到了良好的療效。因此本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)深入研究了抗601合劑的潛在作用機(jī)制。

Figure 5 Top 10 pathways for KEGG enrichment analysis of targets of Anti-601 Mixture

Figure 6 Molecular docking mode between PTGS2 and active compounds in Anti-601 MixtureA:Stigmasterol and PTGS2;B:Quercetin and PTGS2;C:Luteolin and PTGS2;D:Locust flavin and PTGS2;E:β-sitosterol and PTGS2;F:Kaempferol and PTGS2

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，篩選得出抗601合劑的主要有效成分是槲皮素，其次為豆甾醇、β-谷甾醇、漢黃芩素、木犀草素等，這些化合物發(fā)揮抗病毒抗炎作用的主要作用靶點(diǎn)為PTGS2。通過(guò)分子對(duì)接技術(shù)，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)活性成分豆甾醇、槲皮素、木犀草素、β-谷甾醇、漢黃芩素與PTGS2結(jié)合能均小于0，可以自發(fā)結(jié)合，一般認(rèn)為當(dāng)配體與受體結(jié)合的構(gòu)象穩(wěn)定時(shí)能量越低，發(fā)揮作用的可能性越大，說(shuō)明抗601合劑的核心化合物與主要靶點(diǎn)PTGS2親和力較高，是抗病毒抗炎機(jī)制的潛在基礎(chǔ)。

TNF參與全身炎性反應(yīng)，既促進(jìn)淋巴細(xì)胞的炎癥及免疫反應(yīng)，又促進(jìn)其他炎癥因子釋放［8］，其中TNF-α通過(guò)激活NF-κB發(fā)揮促炎作用，而NF-κB信號(hào)通路是炎癥反應(yīng)相關(guān)的關(guān)鍵信號(hào)通路，該通路的活化可誘導(dǎo)多種炎癥因子如TNF-α、IL-1β、IL-6的產(chǎn)生，且正反饋調(diào)節(jié)NF-κB的進(jìn)一步激活活化［9］。本研究KEGG通路富集分析，排在首位的是AGE-RAGE信號(hào)通路，該通路可激活NF-κB，引起促炎因子過(guò)表達(dá)與釋放，造成慢性細(xì)胞活化與組織損傷［10］?？?01合劑的作用機(jī)制也涉及到IL-17通路，Nrf2-IL-17D調(diào)控軸在感染過(guò)程中被激活，IL-1β、IL-6、PTGS2、TNF 均為 IL-17通 路的 重要媒介［11-12］。

文獻(xiàn)報(bào)道，槲皮素具有多種藥理作用，可以誘導(dǎo)TNF增強(qiáng) 2'，5'-低聚腺苷酸（2-5a）合成酶的作用，增強(qiáng)對(duì)腦心肌炎病毒（encephalomyocarditis virus，EMCV）和單純皰疹病毒1型（herpes simplex virus type 1，HSV-1）的抗病毒作用，從而增強(qiáng)IFN-β的生成［13］，通過(guò)抑制TLR4/NF-κB 信號(hào)通路，降低炎癥因子分泌［14-16］。另外，漢黃芩素能抑制流感病毒感染后巨噬細(xì)胞內(nèi)炎癥因子的生成［17］，具有明顯抗炎作用［18］，可通過(guò)激活Nrf2/AGE信號(hào)通路抑制IL-1β刺激引起的MAPK信號(hào)通路活化，從而抑制炎癥反應(yīng)［19］；漢黃芩素可以減少巨噬細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）產(chǎn)生，抑制NF-κB調(diào)控的炎性因子分泌，從而調(diào)控巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)［20］。木犀草素能抑制流感病毒增殖和炎癥因子表達(dá)，影響TLR信號(hào)通路，減輕病毒對(duì)宿主細(xì)胞的免疫損傷，發(fā)揮抗病毒作用［21］。β-谷甾醇可抑制 TNF-α 釋放與聚集［22］，豆甾醇能顯著降低炎癥因子PTGS2、IL-1β、IL-6和MCP-1的表達(dá)，顯示良好的抗炎活性［23］。此外，黃芩素既有抗病毒作用，也可通過(guò)抑制p38MAPK通路減弱SAP大鼠炎性反應(yīng)［24］。

綜上所述，抗601合劑的主要有效成分均具有一定的抗病毒、抑制炎癥作用，尤其對(duì)于皰疹病毒某些分型、甲型流感病毒、乙型肝炎病毒等有抗病毒作用。因此，推測(cè)槲皮素、豆甾醇等有效成分可能通過(guò)PTGS2靶點(diǎn)，參與影響AGE-RAGE、IL-17、TNF、NF-κB等信號(hào)通路，減少炎癥因子分泌，一定程度抑制病毒增殖，減輕病毒的免疫損傷，從而發(fā)揮抗病毒抗炎作用。

本研究亦有一定的局限性，對(duì)于有效成分和靶點(diǎn)基因之間的相互作用是直接作用還是間接作用無(wú)法判斷，且未考慮每種化合物具體含量，后期將對(duì)其具體作用機(jī)制進(jìn)一步充分研究。