沈 杰，查 倩，高向東，陳 松

（中國(guó)藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院江蘇省生物藥物成藥性研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京211198）

線粒體是細(xì)胞內(nèi)有氧呼吸的主要場(chǎng)所，參與了細(xì)胞代謝、信號(hào)傳導(dǎo)、氧化應(yīng)激等多種重要胞內(nèi)活動(dòng)［1-2］。呼吸鏈在線粒體中發(fā)揮著重要作用，線粒體復(fù)合體Ⅰ是呼吸鏈中結(jié)構(gòu)最復(fù)雜、包含亞基最多的多蛋白復(fù)合體，由45種細(xì)胞核和線粒體基因編碼的蛋白裝配而成，相對(duì)分子質(zhì)量約1 000 kD［3-4］，它能夠?qū)ADH中的電子通過黃素單核苷酸傳遞給輔酶Q，并將質(zhì)子傳遞出線粒體內(nèi)膜進(jìn)而產(chǎn)生能量［5-6］，為生命體的生命活動(dòng)提供必要的能量，參與調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞凋亡等生命活動(dòng)，在細(xì)胞能量代謝中發(fā)揮著重要作用［7-8］。

NDUFS7（NADH dehydrogenase（ubiquinone）Fe-S protein 7）是由細(xì)胞核內(nèi)基因編碼，人類NDUFS7基因定位于19號(hào)染色體，編碼的蛋白質(zhì)參與構(gòu)成線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ，相對(duì)分子質(zhì)量約為20 kD，是復(fù)合體Ⅰ疏水亞基的重要組成部分［9-11］。線粒體復(fù)合體Ⅰ功能障礙可導(dǎo)致細(xì)胞功能發(fā)生障礙并退化凋亡，多種神經(jīng)毒素例如MPTP和魚藤酮等已經(jīng)被證明能夠抑制線粒體復(fù)合體Ⅰ的活性從而導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元的退化［12-13］，線粒體功能發(fā)生障礙時(shí)，可能誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位水平異常從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。此外有研究證明神經(jīng)退行性疾病也與復(fù)合體Ⅰ中亞基突變有著密切聯(lián)系［11，14］。NDUFS7 基因作為線粒體復(fù)合體Ⅰ的重要組成部分，其突變可能導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元的退化。課題組前期基于線蟲模型發(fā)現(xiàn)了線粒體復(fù)合體Ⅰ亞基NDUFS7（線蟲NDUF7同源）突變導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元退化［15］，但其對(duì)于人源多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞的影響仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究通過構(gòu)建pcDNA3.1（+）-NDUFS7 Q208STOP突變質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染分化后SH-SY5Y細(xì)胞，考察轉(zhuǎn)染NDUFS7基因突變質(zhì)粒對(duì)多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞活力、凋亡情況以及細(xì)胞內(nèi)Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)量的影響，同時(shí)采用抗氧化劑進(jìn)行干預(yù)，明確轉(zhuǎn)染NDUFS7基因突變質(zhì)粒后可能通過影響線粒體正常功能導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

1 材料

1.1 試劑

DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（美國(guó)Gibco公司）；DNA Marker（日本 TaKaRa公司）；Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑、蛋白預(yù)染Marker、蛋白酶和磷酸酶抑制劑（美國(guó)Thermo公司）；Bax、Bcl-2抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（美國(guó)Cell Signaling Technology公司）；β-actin抗體（中國(guó)Abclonal公司）；胰蛋白酶（美國(guó)Sigma公司）；MTT、氨芐青霉素、鏈霉素、牛血清白蛋白（中國(guó)Biosharp公司）；PVDF膜、ECL試劑盒（美國(guó)Millipore公司）；BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒、RIPA細(xì)胞裂解液、一抗稀釋液、Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒、Hoechst 33342、碘化丙啶（propidium iodide，PI）（中國(guó)碧云天生物技術(shù)研究所）；其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀器

高速冷凍離心機(jī)、全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀、NanoDrop 2000C超微量分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo公司）；倒置相差顯微鏡、倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；TDZ5-WS臺(tái)式離心機(jī)（湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）；流式細(xì)胞儀（美國(guó)Becton-Dickinson公司）。

1.3 菌株和細(xì)胞

TOP10菌株、神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y細(xì)胞株購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心（ATCC）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及其誘導(dǎo)分化

SH-SY5Y細(xì)胞于含10%胎牛血清，1×105IU/L氨芐青霉素，100 mg/L鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)。3 d后，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞按1∶3進(jìn)行傳代，于含有終濃度為10 μmol/L反式維甲酸的DMEM高糖培養(yǎng)基中分化，連續(xù)分化6 d，每2 d換液一次，第7天進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 pcDNA3.1(+)-NDUFS7 Q208STOP質(zhì)粒的構(gòu)建

將人源NDUFS7基因208位谷氨酰胺密碼子突變?yōu)榻K止密碼子，與pcDNA3.1（+）質(zhì)粒連接構(gòu)建pcDNA3.1（+）-NDUFS7 Q208STOP突變質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至TOP10菌株中，使用LB培養(yǎng)基對(duì)含有突變基因質(zhì)粒的TOP10菌株進(jìn)行擴(kuò)增，接種于含100 mg/L氨芐青霉素的LB平板上，37℃培養(yǎng)過夜，挑取陽(yáng)性單克隆，于LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)增并制成甘油菌保存。

2.3 pcDNA3.1(+)-NDUFS7 Q208STOP質(zhì)粒的鑒定

將含有pcDNA3.1（+）-NDUFS7 Q208STOP質(zhì)粒的TOP10菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至A為2.0～3.0，使用無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒提取質(zhì)粒。使用EcoRⅠ、XbaⅠ對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切后制樣，取樣品溶液10 μL于1.0%瓊脂糖凝膠中上樣，90 V，30 min電泳，凝膠成像儀成像并拍照。

2.4 MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-NDUFS7 Q208STOP突變質(zhì)粒對(duì)細(xì)胞活力的影響

實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、pcDNA3.1（+）對(duì)照組、pcDNA3.1（+）-NDUFS7 Q208STOP突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組。收集生長(zhǎng)狀態(tài)良好的分化后SH-SY5Y細(xì)胞，以每毫升5×104個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每孔100 μL，在含5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)過夜。待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%左右，更換無血清opti-MEM培養(yǎng)基，2 h后進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。按每孔Lipofectamine 3000 0.15 μL、P3000 0.2 μL、DNA 0.1 μg進(jìn)行 pcDNA3.1（+）-NDUFS7 Q208STOP質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染，共同孵育5 h后將培養(yǎng)基換為含1%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h后，MTT法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞活力：每孔加入MTT溶液10 μL，于含5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃孵育4 h后吸出上清液，加入DMSO 150 μL并置于酶標(biāo)板振蕩器上500 r/min振蕩10 min，以570 nm檢測(cè)波長(zhǎng)，630 nm參比波長(zhǎng)于酶標(biāo)儀中檢測(cè)各孔吸收度。

2.5 AnnexinⅤ-FITC/PI雙染結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-NDUFS7 Q208STOP突變質(zhì)粒對(duì)細(xì)胞凋亡情況的影響

實(shí)驗(yàn)分組同“2.4”項(xiàng)。收集生長(zhǎng)狀態(tài)良好的分化后SH-SY5Y細(xì)胞，以每毫升5×104個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中，每孔1 000 μL，在含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)過夜。待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%左右，更換無血清opti-MEM培養(yǎng)基，2 h后進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。每孔Lipofectamine 3000 3.75 μL、P3000 5 μL、DNA 2.5 μg 進(jìn) 行 pcDNA3.1（+）-NDUFS7 Q208STOP質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染，共同孵育5 h后將培養(yǎng)基換為含1%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h后，AnnexinⅤ-FITC/PI雙染結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組中細(xì)胞凋亡情況。具體步驟為：將細(xì)胞培養(yǎng)液吸至EP管中，PBS洗滌細(xì)胞一次，加入適量0.25%胰酶消化液消化細(xì)胞，室溫孵育1 min；加入收集的細(xì)胞培養(yǎng)液，把細(xì)胞輕輕吹打下來，轉(zhuǎn)移至EP管中，1 500 r/min離心5 min，棄上清液，收集細(xì)胞，用PBS輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)；取10萬個(gè)重懸細(xì)胞，1 500 r/min離心5 min，棄上清液，加入Annexin V-FITC結(jié)合液195 μL重懸細(xì)胞；加入Annexin V-FITC溶液5 μL混勻，再加入PI溶液10 μL混勻；室溫避光孵育20 min，置于冰浴中，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞熒光值。

2.6 Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-NDUFS7 Q208STOP突變質(zhì)粒對(duì)細(xì)胞內(nèi)Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)量的影響

實(shí)驗(yàn)分組同“2.4”項(xiàng)。按照“2.5”項(xiàng)中的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行分化后SH-SY5Y細(xì)胞鋪板和pcDNA3.1（+）-NDUFS7 Q208STOP突變質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染。培養(yǎng)48 h后，提取細(xì)胞內(nèi)總蛋白，Western blot檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組中Bax、Bcl-2蛋白水平變化。具體步驟為：PBS洗滌細(xì)胞3次后置于冰上，每孔中加入RIPA細(xì)胞裂解液（按1∶100加入蛋白酶、磷酸酶抑制劑混合液）100 μL；使用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞刮下并轉(zhuǎn)移至EP管中，置于冰上保存；使用渦旋儀充分振蕩裂解，每3 min 1次，共30 min；置于高速冷凍離心機(jī)中，4℃、12 000 r/min離心10 min收集上清液即為細(xì)胞內(nèi)蛋白溶液。制樣后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，使用半干法將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，3%脫脂奶粉封閉1 h，TBST洗滌3次，每次10 min；一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗滌5次，每次5 min；二抗室溫孵育2 h，TBST洗滌5次，每次5 min，ECL顯色成像并拍照。

2.7 JC-1探針檢測(cè)抗氧化劑Trolox及轉(zhuǎn)染pc DNA3.1(+)-NDUFS7 Q208STOP突變質(zhì)粒對(duì)分化后SH-SY5Y細(xì)胞線粒體膜電位的影響

實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、pcDNA3.1（+）對(duì)照組、pcDNA3.1（+）-NDUFS7 Q208STOP突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、pcDNA3.1（+）-NDUFS7 Q208STOP+Trolox轉(zhuǎn)染后給藥干預(yù)組。按照“2.5”項(xiàng)下方法進(jìn)行細(xì)胞鋪板和突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染并在換液時(shí)使用終濃度為10 μmol/L的抗氧化劑Trolox進(jìn)行給藥干預(yù)。細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，JC-1探針檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組中細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位水平變化情況。具體步驟為：取適量JC-1（200×）探針，按每50 μL 探針加入超純水8 mL的比例進(jìn)行稀釋，劇烈渦旋使之混勻，再加入JC-1染色緩沖液（5×）2 mL充分混勻；吸去細(xì)胞培養(yǎng)液，使用PBS洗滌1次，每孔加入細(xì)胞培養(yǎng)基1 mL，再加入JC-1染色工作液1 mL，充分混勻，于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育20 min；吸去JC-1染色工作液，使用JC-1染色緩沖液（1×）洗滌2次，每孔加入無血清培養(yǎng)基2 mL，使用倒置熒光顯微鏡進(jìn)行觀察拍照。

2.8 Hoechst/PI雙染檢測(cè)抗氧化劑Trolox對(duì)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-NDUFS7 Q208STOP突變質(zhì)粒的分化后SH-SY5Y細(xì)胞凋亡情況的干預(yù)作用

實(shí)驗(yàn)分組同“2.7”項(xiàng)。按照“2.5”項(xiàng)下方法進(jìn)行細(xì)胞鋪板和突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染并在換液時(shí)使用終濃度為10 μmol/L抗氧化劑Trolox進(jìn)行給藥干預(yù)。細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，PI/Hoechst雙染進(jìn)一步檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組中細(xì)胞凋亡情況。具體步驟為：棄去6孔板中培養(yǎng)基，使用PBS洗滌細(xì)胞2次，每孔加入含有終濃度為7 mmol/L Hoechst 33342的DMEM高糖培養(yǎng)基1 000 μL于37℃培養(yǎng)箱中孵育25 min；PBS洗滌細(xì)胞2次，每孔加入含有終濃度為2 mmol/L PI的DMEM高糖培養(yǎng)基1 000 μL，室溫下避光孵育15 min；染色完成后，PBS洗滌3次，熒光顯微鏡觀察并拍照。

2.9 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，各項(xiàng)指標(biāo)以xˉ±s表示，來源于至少3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，以O(shè)ne-way ANOVA檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，P＜0.05時(shí)表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 pcDNA3.1(+)-NDUFS7 Q208STOP突變質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定

構(gòu)建pcDNA3.1（+）-NDUFS7 Q208STOP突變質(zhì)粒，采用EcoRⅠ、XbaⅠ雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證質(zhì)粒正確性。結(jié)果如圖1所示，條帶2中出現(xiàn)大小約為650 bp（NDUFS7突變基因條帶）和5 400 bp的兩個(gè)條帶，說明質(zhì)粒構(gòu)建基本正確。進(jìn)一步測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果與預(yù)期構(gòu)建的序列完全一致，表明已成功構(gòu)建pcDNA3.1（+）-NDUFS7 Q208STOP突變質(zhì)粒。

Figure 1 Plasmid profile(A)and the agarose gel electrophoresis of enzyme digested plasmids(B)Line M:Marker;Line 1:pcDNA3.1(+)-NDUFS7 Q208STOP;Line 2:pcDNA3.1(+)-NDUFS7 Q208STOP digested by EcoR I and Xba I

3.2 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-NDUFS7 Q208STOP突變質(zhì)粒對(duì)神經(jīng)細(xì)胞活力的影響

轉(zhuǎn)染pcDNA3.1（+）-NDUFS7 Q208STOP突變質(zhì)粒48 h后，MTT法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)細(xì)胞活力。結(jié)果如圖2所示，與轉(zhuǎn)染pcDNA3.1（+）實(shí)驗(yàn)組相比，轉(zhuǎn)染突變質(zhì)粒實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞活力顯著降低，說明轉(zhuǎn)染NDUFS7突變質(zhì)粒會(huì)導(dǎo)致分化后SH-SY5Y細(xì)胞活力下降。

3.3 AnnexinⅤ-FITC/PI雙染結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-NDUFS7 Q208STOP突變質(zhì)粒對(duì)細(xì)胞凋亡水平的影響

轉(zhuǎn)染pcDNA3.1（+）-NDUFS7 Q208STOP突變質(zhì)粒48 h后，采用AnnexinⅤ-FITC/PI雙染結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡水平的變化。結(jié)果如圖3所示，與轉(zhuǎn)染pcDNA3.1（+）實(shí)驗(yàn)組相比，轉(zhuǎn)染突變質(zhì)粒實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)細(xì)胞凋亡比例顯著上升，說明轉(zhuǎn)染NDUFS7基因突變質(zhì)粒能夠?qū)е露喟桶纺苌窠?jīng)細(xì)胞的凋亡。

Figure 2 Cell viability after transfection with pcDNA3.1(+)-NDUFS7 Q208STOP mutant plasmid in differentiated SH-SY5Y cells was analyzed by the MTT assay(-x±s,n=10)

3.4 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-NDUFS7 Q208STOP突變質(zhì)粒對(duì)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)量的影響

轉(zhuǎn)染pcDNA3.1（+）-NDUFS7 Q208STOP突變質(zhì)粒48 h后，采用Western blot檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)Bax、Bcl-2表達(dá)量的變化。結(jié)果如圖4所示，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染突變質(zhì)粒后，分化后SH-SY5Y細(xì)胞中促凋亡蛋白Bax表達(dá)量和抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)量的比值顯著上升，說明轉(zhuǎn)染NDUFS7基因突變質(zhì)粒后可以通過誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白Bax/Bcl-2的改變，對(duì)多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞的凋亡起到促進(jìn)作用。

Figure 3 The cell apoptosis level after transfection with pcDNA3.1(+)-NDUFS7 Q208STOP mutant plasmid in differentiated SH-SY5Y cells for 48 h(-x±s,n=3)A:Analysis of the proportion of apoptotic cells in differentiated SH-SY5Y cells by flow cytometry;B:Quantification of apoptotic cell proportion

Figure 4 Effects of transfection with pcDNA3.1(+)-NDUFS7 Q208STOP mutant plasmid on the levels of Bax and Bcl-2 in differentiated SH-SY5Y cells(-x±s,n=3)A:Detection of Bax and Bcl-2 by Western blot;B:Quantitative analysis of Bax/Bcl-2

3.5 抗氧化劑Trolox及轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-NDUFS7 Q208STOP突變質(zhì)粒對(duì)分化后SH-SY5Y細(xì)胞線粒體膜電位的影響

轉(zhuǎn)染pcDNA3.1（+）-NDUFS7 Q208STOP突變質(zhì)粒并在換液時(shí)使用終濃度為10 μmol/L的Trolox進(jìn)行給藥干預(yù)，孵育48 h后，采用JC-1探針檢測(cè)分化后SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位水平。結(jié)果如圖5所示，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1（+）-NDUFS7 Q208STOP突變質(zhì)粒后綠色熒光增強(qiáng)，說明細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位降低，而抗氧化劑Trolox給藥干預(yù)后，出現(xiàn)較強(qiáng)的紅色熒光，說明Trolox可緩解轉(zhuǎn)染突變質(zhì)粒導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位異常。結(jié)果表明NDUFS7突變質(zhì)粒導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞異?？杀豢寡趸瘎㏕rolox緩解。

Figure 5 Effects of Trolox and transfection with pcDNA3.1(+)-NDUFS7 Q208STOP mutant plasmid on the mitochondrial membrane potential in differentiated SH-SY5Y cells

3.6 抗氧化劑Trolox對(duì)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-NDUFS7 Q208STOP突變質(zhì)粒的分化后SH-SY5Y細(xì)胞凋亡情況的干預(yù)作用

轉(zhuǎn)染pcDNA3.1（+）-NDUFS7 Q208STOP突變質(zhì)粒并在換液時(shí)使用Trolox進(jìn)行給藥干預(yù)，孵育48 h后，采用PI/Hoechst雙染法檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況并使用熒光顯微鏡觀察進(jìn)行拍照。結(jié)果如圖6所示，與空白對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染突變質(zhì)粒后凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增多，而使用Trolox給藥干預(yù)后凋亡細(xì)胞數(shù)量顯著降低，說明抗氧化劑Trolox能夠改善轉(zhuǎn)染突變質(zhì)粒后導(dǎo)致的多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

4 討論

Figure 6 Effects of Trolox and transfection with pcDNA3.1(+)-NDUFS7 Q208STOP mutant plasmid on apoptosis in differentiated SH-SY5Y cells Scar bar:200 μm

多巴胺能神經(jīng)元是以多巴胺作為神經(jīng)遞質(zhì)的神經(jīng)元，人類大腦中約有40萬個(gè)多巴胺能神經(jīng)元。多巴胺能神經(jīng)元參與調(diào)節(jié)機(jī)體對(duì)環(huán)境的反應(yīng)，對(duì)機(jī)體運(yùn)動(dòng)能力、認(rèn)知能力都發(fā)揮著重要作用［16］。多巴胺能神經(jīng)元與大腦學(xué)習(xí)能力密不可分［17］，而且多種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展與多巴胺能神經(jīng)元之間有著密切的聯(lián)系［18-19］，其中帕金森病的主要病理特征即為中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元損傷導(dǎo)致的紋狀體多巴胺嚴(yán)重缺失［20］。線粒體功能障礙是多巴胺能神經(jīng)元退化凋亡的重要原因之一，與線粒體功能相關(guān)的多個(gè)蛋白（如LRRK2、ATP13A2等）與帕金森病有著顯著的關(guān)聯(lián)［21］。線粒體復(fù)合體Ⅰ是線粒體呼吸鏈的關(guān)鍵成分之一，復(fù)合體Ⅰ中亞基的突變與PD、Leigh綜合征等神經(jīng)退行性疾病有著密切聯(lián)系［22］。例如Leigh綜合征與線粒體復(fù)合體Ⅰ中23個(gè)基因的突變有關(guān)，包括NDUFS1、NDUFS2、NDUFS8等［23］。本課題組前期報(bào)道了線蟲中NDUF7基因突變能夠引起多巴胺能神經(jīng)元特異性退化［15］，進(jìn)一步于本研究中證明了在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中NDUFS7（線蟲NDUF7同源）基因突變與多巴胺能神經(jīng)元凋亡之間的聯(lián)系，并且揭示突變型NDUFS7質(zhì)?？赡苁峭ㄟ^誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞線粒體功能異常進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

本研究設(shè)計(jì)并構(gòu)建pcDNA3.1（+）-NDUFS7 Q208STOP突變質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染分化后SH-SY5Y細(xì)胞，進(jìn)而影響線粒體復(fù)合體Ⅰ的正常功能，證明了哺乳動(dòng)物多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染NDUFS7基因突變質(zhì)粒后能夠?qū)е录?xì)胞凋亡。同時(shí)，本研究揭示了抗氧化劑給藥干預(yù)后能夠改善轉(zhuǎn)染突變質(zhì)粒導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞線粒體膜電位異常，從而降低細(xì)胞凋亡水平。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明轉(zhuǎn)染NDUFS7基因突變質(zhì)粒后，通過引起細(xì)胞內(nèi)線粒體功能異常導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元凋亡，證明了突變型NDUFS7質(zhì)粒導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元凋亡的作用及機(jī)制，為與多巴胺能神經(jīng)元退化凋亡相關(guān)的疾病和藥物研究提供新的思路和理論依據(jù)。