林愛花，劉 錦，陳巖青，張 巖，于 洋*

（1上海交通大學藥學院，上海200240；2上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院上海市腫瘤研究所，癌基因與相關基因國家重點實驗室，上海200240）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）是一種典型的中樞神經系統(tǒng)退行性疾病。腦內細胞外聚集的老年斑（以β amyloid，即Aβ為主要成分）和細胞內聚集的神經纖維纏結（主要由過度磷酸化的Tau蛋白構成）是AD的兩大病理特征［1-2］。近年來，不斷增加的研究數據表明，腦內的炎癥反應也參與了AD的整個病理進程［3-4］。小膠質細胞在中樞神經系統(tǒng)中發(fā)揮重要免疫作用。在AD患者腦內，小膠質細胞遷移并募集在Aβ斑塊周圍，發(fā)揮免疫功能［5］。血清淀粉樣蛋白A（serum amyloid A，SAA）被認為是主要的急性期反應蛋白。當機體被感染和受到傷害時，其在外周血漿中的濃度可增加1 000倍［6］。SAA具有細胞因子樣特性，參與著機體的各種炎癥反應［7-8］。SAA的免疫功能在外周系統(tǒng)研究較多，但在腦內研究較少。因此，為探究SAA是否參與小膠質細胞在AD中的免疫反應，本研究探索了SAA對小膠質細胞遷移的影響及其作用機制，為AD治療及預防提供理論依據。

1 材料

1.1 試劑

鼠源小膠質細胞系N9（上海生物科學研究院）；Dulbecco's modified Eagle's medium（DMEM）培養(yǎng)基、Iscove's modified Dulbecco's medium（IMDM）培養(yǎng)基、胰酶、胎牛血清（美國Gibco公司）；脂 多 糖（lipopolysaccharide，LPS）（來 源Escherichia coli0111：B4）、WRW4肽、TLR2中和抗體、多聚賴氨酸、ERK抑制劑PD98059、p38抑制劑SB203580、JNK 抑制劑 SP600125、NF-κB 抑制劑SN50（美國Sigma公司）；重組人apo-SAA蛋白（美國PeproTech公司）；TRIzol試劑（美國Invitrogen公司）；反轉錄試劑盒、實時熒光PCR試劑（日本東洋紡公司）；Transwell小室、Falcon?40 μm細胞過濾網（美國Corning公司）；結晶紫粉末（上海生工生物技術有限公司）；RIPA細胞裂解液（碧云天生物技術研究所）；Western blot第二抗體IRDye?800CW、IMDye?800CW（美國LI-COR公司）；Western blot所需第一抗體如表1所示。其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀器

解剖鏡（Olympus SZX7，日本奧林巴斯公司）；實時熒光定量PCR儀器（美國ABI公司）；蛋白免疫印跡電泳系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；Odyssey P140-CLx紅外熒光掃描成像系統(tǒng)（美國Gene公司）。

Table 1 Primary antibodies used in Western blot

2 方 法

2.1 小鼠原代小膠質細胞分離及培養(yǎng)和鼠源N9小膠質細胞培養(yǎng)

原代小膠質細胞分離及培養(yǎng)方法參考文獻報道［9］，取新生1天（不超過24 h）的野生型小鼠，去掉腦殼、中腦、嗅球，去除包裹皮層的膜與胼胝體等。隨后將皮層組織盡量剪碎，胰酶進行消化處理后，加入含10%FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL硫酸鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基平鋪在多聚賴氨酸包被的75 cm2的細胞培養(yǎng)瓶中放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。第1天和第3天時分別更換新的DMEM培養(yǎng)基。至第7天，將培養(yǎng)瓶放入搖床中，以260 r/min轉速在37℃持續(xù)搖動2.5 h后離心即得小膠質細胞。N9小膠質細胞采用含有10%FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL硫酸鏈霉素的IMDM培養(yǎng)基進行常規(guī)培養(yǎng)。

2.2 Transwell小室檢測細胞遷移能力

取孔徑8 μm的小室，在下室加入各組溶液600 μL。收集原代小膠質細胞和對數生長期的N9小膠質細胞，用純培養(yǎng)基稀釋為每毫升5×105個的密度，添加200 μL到上室。對于抑制劑或中和抗體預孵育的實驗，上室細胞提前用配好的抑制劑或中和抗體溶液預孵育細胞15 min再用含有抑制劑或中和抗體的培養(yǎng)基溶液稀釋到所需密度。FPR2受體拮抗劑WRW4使用質量濃度為1，5，10 μmol/L；TLR2中和抗體Anti-mTLR2-IgG使用濃度為 0.1，0.5，1 μg/mL。ERK 抑制劑 PD98059、p38抑制劑SB203580和JNK抑制劑SP600125使用濃度均為20 μmol/L；NF-κB抑制劑SN50使用濃度為10 μmol/L。原代小膠質細胞放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，N9小膠質細胞培養(yǎng)6 h后取出小室。PBS溶液洗滌，浸泡于甲醇溶液15 min，隨后用結晶紫染色30 min。用PBS清洗膜，擦除膜上層細胞。進行了3次獨立實驗，每個樣本取3個視野在顯微鏡下進行觀察和拍照。

2.3 實時熒光定量PCR檢測FPR2和TLR2的mRNA表達

用1 μmol/L SAA刺激N9小膠質細胞1，3，6，9和12 h。Trizol法提取總RNA，反轉錄為cDNA和qRT-PCR反應具體操作均按照說明書進行。PCR條件設定為預變性94℃3 min，94℃30 s，56℃退火45 s，72℃延伸30 s，共40個循環(huán)，接著再72℃10 min。 基因 表達 的結 果計 算 采用 2-ΔΔCt法 ，以GAPDH的mRNA表達作為內參?；虻囊镄蛄腥绫?所示。

Table 2 Primer sequences used for qRT-PCR

2.4 Western blot檢測MAPKs和NF-κB信號通路激酶表達

用1 μmol/L SAA刺激N9小膠質細胞1，5，15，30，60 min后，收集各組細胞，然后采用RIPA裂解細胞。用10%濃度凝膠進行蛋白質電泳，電泳結束后使用NC膜進行轉膜，5%脫脂奶粉在室溫條件進行1 h封閉，分別加入一抗溶液（p-ERK1/2、ERK、p-p38、p38、p-JNK、JNK、IkBα和GAPDH），稀釋比例均為1∶1 000，4℃孵育過夜。第2天采用TBST漂洗，加入對應二抗溶液（IRDye?800CW和IMDye?800CW），避光于搖床上室溫孵育1 h。洗膜后使用紅外熒光掃描成像系統(tǒng)曝光及保存圖片。進行了兩次獨立實驗。

2.5 統(tǒng)計學分析

使用ImageJ Launcher對拍攝的圖片進行分析和定量；使用GraphPad Prism 6軟件統(tǒng)計數據。數據統(tǒng)計結果為-x±s，組間比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結 果

3.1 SAA誘導原代小膠質細胞和N9小膠質細胞遷移

采用Transwell檢測SAA對原代小膠質細胞和N9小膠質細胞遷移能力影響。結果顯示，SAA以濃度依賴性方式促進原代小膠質細胞和N9小膠質細胞的遷移，1 μmol/L SAA的作用效果最強，組間差異具有統(tǒng)計學意義。因為重組蛋白SAA含有微量LPS（小于1.2 ng/mL），因此為排除SAA內LPS的干擾，本研究設計了高于此劑量的LPS（2.5 ng/mL）作為對照組。結果顯示此劑量的LPS對小膠質細胞的遷移并沒有影響（圖1），說明SAA對小膠質細胞的遷移作用并沒有LPS的參與。

Figure 1 Serum amyloid A(SAA)induces migration of primary microglia and N9 microglia(-x ± s,n=9）A:Primary cultures of microglia and N9 microglia was treated with SAA(0.1-1 μmol/L)or LPS(2.5 ng/mL),and the migration was detected by Transwell assay;B:Quantitative analysis of SAA-induced migration of primary microglia;C:Quantitative analysis of SAA-induced migration of N9 microglia

3.2 FPR2受體拮抗劑和TLR2中和抗體抑制了SAA誘導的N9小膠質細胞遷移

因為FPR2和TLR2是SAA的兩個主要受體，為驗證SAA誘導小膠質細胞的遷移是否通過這兩個受體，本研究加入FPR2受體拮抗劑WRW4和TLR2中和抗體檢測SAA對N9小膠質細胞遷移能力影響。結果發(fā)現1，5，10 μmol/L的WRW4均能抑制SAA誘導的N9小膠質細胞遷移（圖2-A，B）。TLR2中和抗體也以濃度依賴性方式抑制SAA誘導的N9小膠質細胞遷移，1 μg/mL SAA的作用效果最強（圖2-C，D）。組間差異有統(tǒng)計學意義。此結果說明SAA通過作用FPR2和TLR2這兩種受體誘導小膠質細胞的遷移。

3.3 SAA誘導N9小膠質細胞FPR2和TLR2受體轉錄水平增加

此外，本研究進一步檢測SAA是否對這兩種受體的表達有影響。使用實時熒光定量PCR方法檢測SAA對N9小膠質細胞FPR2和TLR2受體mRNA表達的影響。結果發(fā)現SAA能夠顯著誘導N9小膠質細胞FPR2和TLR2 mRNA轉錄水平的增加，特別是FPR2受體。SAA誘導FPR2受體轉錄水平呈漸進式的升高，在9 h達到頂點，增加了約70倍（圖3）。而SAA對TLR2的表達誘導呈山峰狀，在6 h達到峰值，增加了約12倍（圖3）。LPS也誘導了這兩個受體轉錄水平微量的增加，但增加的程度遠小于SAA的作用，特別是對于FPR2受體（圖3）。這個結果說明SAA能夠顯著誘導小膠質細胞FPR2和TLR2受體的表達，且對FPR2受體表達的誘導作用更強。

3.4 SAA激活N9小膠質細胞MAPKs和NF-κB信號通路

因為FPR2和TLR2受體激活能夠誘導下游絲裂原激活的蛋白激酶（MAPKs）和核因子κB（NF-κB）信號通路變化，因此采用Western blot檢測SAA對N9小膠質細胞MAPKs和NF-κB信號通路的影響。結果發(fā)現SAA能夠顯著增加細胞外信號調節(jié)激酶（ERK）、p38和c-Jun氨基末端激酶（JNK）磷酸化水平，降低I?Bα表達水平，并且在15 min作用最明顯（圖4）。這個結果說明SAA能夠激活N9小膠質細胞下游MAPKs和NF-κB信號通路。

Figure 2 FPR2 antagonist and TLR2 neutralizing antibody inhibit SAA-induced migration of N9 microglia(-x ± s,n=9）A,B:Effect of FPR2 antagonist(WRW4)on SAA-induced migration of N9 microglia was detected by Transwell assay.(a)Control;(b)1 μmol/L SAA;(c)1 μmol/L WRW4+1 μmol/L SAA;(d)5 μmol/L WRW4+1 μmol/L SAA;(e)10 μmol/L WRW4+1 μmol/L SAA;(f)10 μmol/L WRW4;(g)2.5 ng/mL LPS;(h)10 μmol/L WRW4+2.5 ng/mL LPS.C,D:Effect of TLR2 neutralizing antibody on SAA-induced migration of N9 microglia was detected by Transwell assay.(a)Control;(b)1 μmol/L SAA;(c)0.1 μg/mL Anti-mTLR2-IgG+1 μmol/L SAA;(d)0.5 μg/mL Anti-mTLR2-IgG+1 μmol/L SAA;(e)1 μg/mL Anti-mTLR2-IgG+1 μmol/L SAA;(f)1 μg/mL IgG+1 μmol/L SAA;(g)1 μg/mL Anti-mTLR2-IgG;(h)2.5 ng/mL LPS;(i)1 μg/mL Anti-mTLR2-IgG+2.5 ng/mL LPS.

Figure 3 SAA increases the mRNA levels of FPR2(A)and TLR2(B)in N9 microglia(-x ± s,n=4）

3.5 p38、JNK及NF-κB信號通路參與了SAA誘導的N9小膠質細胞遷移

Figure 4 SAA activates MAPKs and NF-κB signaling pathways in N9 microglia(-x ± s,n=2)A:Effect of SAA on the phosphorylation levels of MAPKs and NF-κB signaling pathway kinases in N9 microglia was examined by Western blot;B:Quantitative analysis of SAA-induced changes in the phosphorylation of ERK;C:Quantitative analysis of SAA-induced changes in the phosphorylation of p38;D:Quantitative analysis of SAA-induced changes in the phosphorylation of JNK;E:Quantitative analysis of SAA-induced changes in the expression of I?Bα

為驗證SAA誘導小膠質細胞的遷移是否通過MAPKs和NF-κB信號通路，采用MAPKs和NF-κB信號通路抑制劑檢測SAA對N9小膠質細胞遷移能力影響。結果發(fā)現ERK抑制劑PD98059不能有效抑制SAA誘導的N9小膠質細胞遷移。而p38抑制劑SB203580、JNK抑制劑SP600125及NF-κB抑制劑SN50均可以顯著抑制SAA誘導的N9小膠質細胞遷移（圖5）。組間差異有統(tǒng)計學意義。此結果說明SAA通過激活p38、JNK及NF-κB信號通路誘導小膠質細胞的遷移。

Figure 5 Inhibitor of p38，JNK，or NF-κB inhibits SAA-induced migration of N9 microglia(-x ± s,n=9）A,B:Effect of inhibitors of MAPKs(ERK,p38,and JNK)and NF-κB on SAA-induced migration of N9 microglia was detected by Transwell assay.(a)Control group;(b)1 μmol/L SAA;(c)20 μmol/L PD98059+1 μmol/L SAA;(d)20 μmol/L SB203580+1 μmol/L SAA;(e)20 μmol/L SP600125+1 μmol/L SAA;(f)10 μmol/L SN50+1 μmol/L SAA;(g)20 μmol/L PD98059;(h)20 μmol/L SB203580;(i)20 μmol/L SP600125;(j)10 μmol/L SN50

4 討論

外周血液循環(huán)中的血清淀粉樣蛋白A主要是由急性期反應中的肝細胞合成的，而在肝外產生的SAA被認為與包括AD在內的慢性炎癥疾病更為相關［10］。然而，目前關于SAA在中樞神經系統(tǒng)及神經膠質細胞中的作用研究較少。本研究中，采用重組蛋白SAA作用小膠質細胞，證明SAA能夠通過FPR2、TLR2受體，激活MAPK和NF-κB信號通路，進而促進小膠質細胞的遷移。這些結果為SAA在中樞神經系統(tǒng)炎癥性疾病中的作用提供了新的證據。

有研究報道AD患者腦脊液中SAA的濃度顯著高于正常對照組［11］。免疫組織化學方法檢測結果表明SAA與Aβ斑塊共定位［12］。而且，SAA轉基因小鼠在誘導全身性急性期反應后增加了淀粉樣蛋白的沉積［13］。最近有研究表明，SAA和AD小鼠記憶衰退有關［14-15］。本實驗室前期研究表明，SAA刺激能夠激活原代小膠質細胞，劑量依賴性地增強小膠質細胞的增殖能力，抑制小膠質細胞凋亡［9］。小膠質細胞在中樞免疫反應中發(fā)揮重要作用。在AD患者腦內，小膠質細胞通過遷移圍繞在Aβ斑塊附近，發(fā)揮免疫反應，吞噬和釋放炎癥因子等［5］。然而，并沒有研究報道SAA對膠質細胞遷移的影響。因此，本研究中首先探究了SAA是否影響小膠質細胞的遷移能力。結果發(fā)現，SAA能夠以濃度依賴性方式促進原代小膠質細胞和N9小膠質細胞遷移（圖1）。之前的研究顯示SAA具有趨化因子特性。SAA對人單核細胞、中性粒細胞、未成熟樹突狀細胞、T細胞、肥大細胞、內皮細胞、平滑肌細胞和滑膜成纖維細胞有明顯的趨化作用［16］。并且，小鼠皮下注射SAA可誘導中性粒細胞和單核細胞顯著募集到注射部位，表明SAA趨化特性［17］。本研究的結果首次表明，SAA對腦內的小膠質細胞也具有趨化遷移的作用。

研究表明SAA可以與多種受體結合，產生相應的生物學功能。對于中性粒細胞，SAA可以結合其細胞表面的FPR2和TLR2受體，進而激活細胞內的 MAPKs、PI3K 和 NF-κB 等信號通路［18-19］。例如，SAA通過結合FPR2可以促進中性粒細胞遷移，也可以增加趨化因子表達進而結合TLR2受體協(xié)同增強誘導白細胞遷移的能力［20］。因此，采用這兩種受體的拮抗劑和/或中和抗體，發(fā)現它們均能有效抑制SAA誘導的N9小膠質細胞的遷移。這些結果表明SAA通過FPR2和TLR2受體促進小膠質細胞遷移。此外，本研究還驗證了SAA對N9小膠質細胞FPR2和TLR2受體表達，即其mRNA轉錄水平的影響。結果發(fā)現SAA能夠促進N9小膠質細胞內這兩種受體mRNA轉錄水平的增加（圖3）。本課題組之前的研究也表明SAA能誘導原代小膠質細胞這兩種受體轉錄水平的增加［9］，提示SAA還能夠通過誘導這兩種受體表達增加，進一步增強其對小膠質細胞遷移的促進作用。

此外，本研究還檢測了SAA對N9小膠質細胞內MAPKs和NF-κB信號通路的影響。已有研究報道細胞遷移與MAPKs和NF-κB通路的激活密切相關。表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）和產促紅細胞生成素肝細胞受體結合蛋白（erythropoietin-producing hepatocellular receptor interacting protein B1，ePhin B1）誘導的細胞遷移與JNK信號通路活化密切相關［21-22］。p38的特異性抑制劑SB203580和SB202190能夠有效抑制由血小板源性生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF）、轉 化 生 長 因 子 β（transforming growth factor β，TGFβ）和白介素 1β（interleukin-1β，IL-1β）誘導的平滑肌細胞遷移［23］。ERK通路抑制劑PD98059和U0126則可抑制細胞基質蛋白對不同類型細胞的遷移［21］。NF-κB對于激活素誘導的大腸癌細胞遷移至關重要［24］。本研究結果發(fā)現SAA能夠激活N9小膠質細胞內MAPKs（ERK、p38和JNK）和NF-κB信號通路，表明SAA可能通過這些信號通路誘導小膠質細胞遷移。進一步的實驗發(fā)現，p38、JNK及NF-κB信號通路抑制劑能夠顯著抑制SAA誘導的N9小膠質細胞遷移，提示SAA通過激活這些信號通路誘導小膠質細胞的遷移。未來的研究中，將通過體內動物實驗，探究SAA如何通過影響小膠質細胞遷移參與AD的病理進程。此外，有研究表明MAPKs和NF-κB信號通路的激活能夠誘導FPR2和/或 TLR2 受體表達上調［25-26］。因此，SAA誘導這兩種受體表達增加可能與其激活的下游MAPKs和NF-κB信號通路有關，但具體的相關機制還需要進一步的實驗驗證。

綜上所述，本研究首次發(fā)現SAA能夠促進小膠質細胞的遷移，其機制是通過作用于其細胞表面的FPR2和TLR2受體，激活下游的MAPKs和NF-κB信號通路。SAA還通過增加這兩種受體的表達，進一步促進小膠質細胞遷移。本課題組之前的研究發(fā)現，SAA刺激小膠質細胞釋放的白介素 10（interleukin-10，IL-10）能夠降低原代培養(yǎng)神經元由于LPS引起的Tau蛋白過度磷酸化［27］。這些研究結果表明SAA可以通過調節(jié)小膠質細胞參與AD中的神經炎癥反應，提示SAA可作為AD治療和預防的一個重要的潛在靶點。