楊殿江， 蒲 齡， 向小英 ， 李培珍， 徐景峨， 張亞楠， 陶宇航， 韓 雪， 楊 莉

(1. 湖南省芷江侗族自治縣畜牧水產(chǎn)事務中心，湖南 芷江 419100； 2. 貴州省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，貴州 貴陽 550005)

鴨疫里氏桿菌病(或鴨疫里默氏桿菌病)是由鴨疫里氏桿菌 (Riemerellaanatipestifer， RA)感染引起的1種細菌性傳染病， 又名鴨傳染性漿膜炎、新鴨病、鴨敗血病、鴨疫綜合征，主要感染1～8周齡的水禽，病死率可高達80%[1，2]。臨床表現(xiàn)弓角反張、共濟失調(diào)、行動遲緩，眼鼻流出黏液性分泌物，拉綠色或黃白色稀糞等癥狀；病理變化主要為纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊混濁[3～5]。國際上將RA分為21個血清型，其中1型和2型是我國主要流行的血清型[6]。此外各地區(qū)、各養(yǎng)殖場流行的血清型也不盡相同，呈多血清型感染流行態(tài)勢[7，8]，甚至同1個場有2種以上的血清型感染。由于各血清型之間沒有交叉保護，給疫苗的研制帶來極大困難，且抗生素的濫用加劇了耐藥菌株的產(chǎn)生，使鴨疫里氏桿菌病的防控工作艱巨，給養(yǎng)殖業(yè)造成很大的經(jīng)濟損失。2020年4月，湖南省芷江侗族自治縣某鵝場的10日齡雛鵝出現(xiàn)精神萎靡、食欲下降，排綠色稀糞，部分出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，病死率30%。解剖病鵝可見肝臟表面有1層白色薄纖維素性膜；心包膜增厚，有纖維素樣物滲出。經(jīng)貴州省畜牧獸醫(yī)研究所畜禽疫病研究室檢測診斷為鴨疫里氏桿菌病?，F(xiàn)將診斷情況報道如下，供參考。

1 材料與方法

1.1 檢測病料無菌采集5只病鵝的腦、心臟、肝臟組織作為檢測病料。

1.2 培養(yǎng)基與試劑胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基、酵母浸出物、麥康凱培養(yǎng)基、伊紅美藍培養(yǎng)基、甘露醇鹽瓊脂培養(yǎng)基(購自青島海博生物技術有限公司)，新生牛血清(購自浙江天杭微生物科技股份有限公司)，2×Es MasterMix(購自北京世紀康為生物科技有限公司)，核酸染料(購自北京索萊寶科技有限公司)。

1.3 細菌分離與鑒定

1.3.1 細菌分離培養(yǎng)將無菌采集的病鵝腦、心臟、肝臟病料分別劃線接種至含5%新生牛血清、0.5%酵母浸出物的胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基，置于CO2培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)24～36 h。挑取生長的單個菌落分別接種至含5%新生牛血清和0.5%酵母浸出物的胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、伊紅美藍培養(yǎng)基、甘露醇鹽瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃ 16 h 純化培養(yǎng)，觀察菌落生長情況。

1.3.2 染色鏡檢挑取純化后的菌落進行革蘭氏染色鏡檢，觀察細菌形態(tài)。

1.3.3 PCR鑒定用水煮法提取分離菌的DNA，根據(jù)GenBank登錄的鴨疫里氏桿菌ompA基因序列為(登錄號：KY399243.1)設計引物。引物序列為F：5’-ACTCCGCCATTGTCTAAG-3’；R：5’-CCGT CACCATCTGTATCT-3’。預擴增PCR產(chǎn)物長度584 bp。PCR擴增體系：2×Es MasterMix 12.5 μL，DNA 2 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，ddH2O 加至 25 μL；同時設置陽性對照和陰性對照。PCR反應程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，擴增30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。最后將PCR產(chǎn)物進行1%核酸瓊脂糖凝膠電泳，初步確定是否為目的條帶。將PCR擴增產(chǎn)物送至上海生工生物工程技術服務有限公司測序，測序結果在NCBI網(wǎng)站上進行BLAST比對分析。

1.3.4 藥敏試驗參照WHO推薦的K-B紙片法對分離菌進行藥敏試驗，以大腸桿菌ATCC 25922為質(zhì)控菌株，結果按NCCLS標準做出判定。

2 結果

2.1 細菌分離培養(yǎng)、染色鏡檢接種病料在含新生牛血清和酵母的胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基上生長出圓形、半透明、水潤、光滑、直徑2～3 mm的菌落(見圖1)。在麥康凱培養(yǎng)基、伊紅美藍培養(yǎng)基、甘露醇鹽瓊脂培養(yǎng)基無菌落生長。對分離菌株進行革蘭氏染色鏡檢，可見紅色、無芽孢的革蘭氏陰性小桿菌(見圖2)。

圖1 胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基生長菌落

圖2 分離菌革蘭氏染色鏡檢

2.2 PCR鑒定經(jīng)PCR擴增，分離菌株在584 bp處出現(xiàn)清晰條帶(見圖3)。PCR擴增產(chǎn)物測序結果與GenBank報道的RA序列同源性達99%，鑒定該分離菌株為鴨疫里氏桿菌(命名為RAZJ01)。

M：DL 2 000 DNA Marker； 1：分離菌PCR產(chǎn)物； 2：陽性對照； 3：陰性對照圖3 分離菌株PCR擴增電泳

2.3 藥敏試驗由表1 可見：分離菌株對頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢噻呋、阿莫西林、氨芐西林敏感；對氟苯尼考、恩諾沙星中度敏感；對青毒素G、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、強力霉素、卡那霉素、阿米卡星、磺胺異惡唑、鏈霉素耐藥。

表1 藥敏試驗結果

3 結論

3.1本試驗通過對發(fā)病雛鵝病料進行細菌分離培養(yǎng)、染色鏡檢、PCR鑒定，確定分離菌株為鵝源鴨疫里氏桿菌(命名為RAZJ01)，結合發(fā)病鵝臨床癥狀、病理變化，確診為鴨疫里氏桿菌病。

3.2藥敏試驗結果表明，RA分離菌株對頭孢類(頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢噻呋)、阿莫西林、氨芐西林敏感，與雍燕等[9]研究結果一致；對青毒素G、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、強力霉素、卡那霉素、阿米卡星、磺胺異惡唑、鏈霉素耐藥，與駱延波等[10]研究結果一致。建議該場選用敏感藥物頭孢類、阿莫西林、氨芐西林進行防治。