張喜懿， 溫貴蘭*， 陳 廣， 田 浪， 楊佰啟， 張小波

(1. 貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025； 2. 貴州省動物生物制品工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽 550016)

鴨疫里默氏桿菌病(或鴨疫里氏桿菌病)是由鴨疫里默氏桿菌(Riemerellaanatipestifer， RA)引起鴨的1種接觸傳染性疾病，又稱鴨傳染性漿膜炎[1]。該病一年四季均有發(fā)生，不同品種的鴨均可感染發(fā)病，主要發(fā)生于1～8周齡的雛鴨，尤以2～3周齡的雛鴨最易感[2，3]。臨床表現(xiàn)為眼鼻分泌物增多、呼吸急促、共濟(jì)失調(diào)等癥狀，病理變化以纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎等為特征[4～6]。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道，鴨疫里默氏桿菌至少有21個血清型，不同血清型之間交叉免疫保護(hù)性很低，疫苗效果較差；防控該病主要采用抗生素治療，導(dǎo)致菌株產(chǎn)生較嚴(yán)重的耐藥性[7～9]。2019年12月，貴州省黔東南州某養(yǎng)殖場送檢1只49日齡病死花邊鴨，通過病理剖檢和細(xì)菌分離培養(yǎng)鑒定診斷為鴨疫里默氏桿菌感染?，F(xiàn)將診斷情況報道如下，供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 檢測病料無菌采集送檢病死鴨的肝臟、心臟、脾臟作為檢測病料。

1.1.2 主要試劑革蘭氏染色劑、細(xì)菌藥敏紙片、微量生化反應(yīng)管(購自杭州微生物試劑有限責(zé)任公司)，2×EsTaqDNA Mix(購自南京諾唯贊生物科技有限公司)，DL 5 000 DNA Marker[購自寶生物工程(大連)有限公司]，配制培養(yǎng)基所用氯化鈉、瓊脂粉、胰蛋白胨、酵母粉(均購自索萊寶生物科技有限公司)。

1.1.3 主要儀器電泳槽(DYCZ-HOB型)、電泳儀電源(DYCZ-8C型)(購自北京市六一儀器廠)，SYGENE電泳凝膠成像儀(購自GENE公司)，多功能梯度PCR儀(VeritiTm 96-Well Thermal Cycler)(購自ABI公司)，迷你離心機(MINI)(購自Scanspeed公司)，37 ℃隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(BD53)(購自BINDER公司)，超凈工作臺(SW-CJ-2D/2G)(購自上海締倫光學(xué)儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 病理剖檢對送檢病死鴨進(jìn)行剖檢，觀察記錄病變，無菌采集相關(guān)病料。

1.2.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)及革蘭氏染色鏡檢將采集的肝臟、心臟、脾臟病料分別接種于普通瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基和鮮血瓊脂培養(yǎng)基，分別于厭氧(5%CO2)與有氧條件下37 ℃培養(yǎng)12～16 h，觀察菌落生長情況。挑取生長的單個菌落接種鮮血瓊脂培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行純培養(yǎng)。取純培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢。

1.2.3 生化試驗無菌挑取純培養(yǎng)的單個菌落接種于生化反應(yīng)管中，于37 ℃培養(yǎng)24～48 h，觀察并記錄結(jié)果。

1.2.4 分離菌16S rRNA PCR檢測及測序

1.2.4.1 引物信息細(xì)菌16S rRNA特異引物參考GenBank中的E05329菌株設(shè)計，送至生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物信息見表1。

表1 引物信息

1.2.4.2 PCR 檢測及測序?qū)⒓兣囵B(yǎng)的單個菌落加入5 μL滅菌ddH2O中，以此為模板進(jìn)行細(xì)菌16S rRNA PCR檢測。反應(yīng)體系 50 μL：上、下游引物(10 mol/μL)各2.5 μL，2×EsTaqDNA Mix 25 μL，模板5 μL，ddH2O 15 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 預(yù)變性 2 min；94 ℃ 變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸 45 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠中電泳檢測。取目的基因膠條送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，測序結(jié)果與GenBank中已有序列進(jìn)行BLAST比對。

1.2.5 藥敏試驗選取27種藥敏紙片通過 K-B 法測定分離菌株的耐藥性，記錄抑菌圈大小，參考美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)《抗微生物藥物敏感性試驗執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)》(2016)判定藥物敏感性。

2 結(jié)果

2.1 病理變化病死鴨心臟和肝臟均有纖維素性包膜(見圖1、圖2)；脾臟腫大，呈大理石樣花紋(見圖3)。

圖1 心臟纖維素性包膜 圖2 肝臟纖維素性包膜 圖3 脾臟腫大，呈大理石樣花紋

2.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)及革蘭氏染色鏡檢普通瓊脂培養(yǎng)基和麥康凱培養(yǎng)基均未見菌落生長。鮮血瓊脂培養(yǎng)基上生長出灰白色、圓形、半透明、不溶血的針尖狀菌落，符合鴨疫里默氏桿菌的菌落特征(見圖4)。取分離菌的純培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，可見單個或成雙排列的革蘭氏陰性小桿菌(見圖5)。

圖4 鮮血瓊脂培養(yǎng)基菌落形態(tài)

圖5 分離菌革蘭氏染色鏡檢(1 000×)

2.3 生化試驗分離菌株僅觸酶和氧化酶反應(yīng)為陽性。不發(fā)酵葡萄糖、乳糖和蔗糖，不利用枸櫞酸鹽，不還原硝酸鹽，硫化氫、精氨酸、尿素酶反應(yīng)為陰性，基本符合鴨疫里默氏桿菌的生化特性。

2.4 分離菌16S rRNA PCR檢測及測序分離菌16S rRNA PCR產(chǎn)物凝膠電泳擴(kuò)增出1 450 bp特異性條帶，與預(yù)擴(kuò)增片段相符(見圖6)。測序結(jié)果顯示分離菌16S rRNA 核苷酸序列長度為1 450 bp；通過GenBank中已有序列進(jìn)行BLAST比對，與鴨疫里默氏桿菌GZ-RA1株的同源性高達(dá)99.8%。根據(jù)序列同源性≥99%可鑒定到種的標(biāo)準(zhǔn)，可鑒定分離菌為鴨疫里默氏桿菌，將此分離株命名為2019GZRA。

M：DL 5 000 DNA Marker； 1：分離菌； -：陰性對照圖6 分離菌16S rRNA PCR檢測結(jié)果

2.5 藥敏試驗分離菌株藥敏試驗結(jié)果顯示對哌拉西林、頭孢哌酮、米諾環(huán)素等8種藥物敏感；對萬古霉素、頭孢拉定、紅霉素、環(huán)丙沙星4種藥物中度敏感；對氨芐西林、卡那霉素、丁胺卡那等15種藥物耐藥(見表2)。

表2 鴨疫里默氏桿菌2019GZRA株藥敏試驗結(jié)果

3 討論

3.1鴨疫里默氏桿菌病與大腸桿菌病均可致鴨心臟、肝臟出現(xiàn)纖維素性包膜，脾臟腫大呈大理石花紋樣[10]。為了鑒別大腸桿菌與鴨疫里默氏桿菌，本試驗在進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)時分別接種了普通瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基和鮮血瓊脂培養(yǎng)基，前2種培養(yǎng)基均未見菌落生長，僅鮮血瓊脂培養(yǎng)基上生長出灰白色、圓形、半透明、不溶血的針尖狀菌落，初步排除了大腸桿菌感染。

3.216S rRNA具有高度的保守性和特異性，是快速、準(zhǔn)確鑒定細(xì)菌的方法。本試驗采用細(xì)菌16S rRNA特異引物對分離菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增和序列同源性分析，確定為鴨疫里默氏桿菌。

3.3據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報道，不同的鴨疫里默氏桿菌菌株對相同藥物的敏感性不同[11，12]。本次共選取27種藥物進(jìn)行藥敏試驗，結(jié)果顯示分離菌株2019GZRA對哌拉西林、頭孢哌酮、米諾環(huán)素等8種藥物敏感，與羅玲等[13]報道的對頭孢類藥物、氨芐西林高度敏感結(jié)果不一致；對氨芐西林、卡那霉素、丁胺卡那等15種藥物耐藥，耐藥率為55.6%，比朱元軍等[14]報道的對14種藥物耐藥更為嚴(yán)重。出現(xiàn)此種情況可能是細(xì)菌分離株的地域差異性所致，也可能是抗菌藥物的長期大量使用導(dǎo)致鴨疫里默氏桿菌對多數(shù)藥物產(chǎn)生了耐藥性。建議該養(yǎng)殖場根據(jù)藥敏試驗結(jié)果使用敏感藥物采取聯(lián)合用藥、穿梭用藥、輪換用藥的方法進(jìn)行抗感染治療，避免造成更大的經(jīng)濟(jì)損失。

4 結(jié)論

本試驗通過細(xì)菌分離培養(yǎng)、革蘭氏染色鏡檢、生化試驗、16S rRNA 序列分析鑒定，從送檢花邊鴨病料中分離出1株鴨疫里默氏桿菌(2019GZRA)，提示發(fā)病鴨場存在鴨疫里默氏桿菌感染。對該場病鴨可選擇哌拉西林、米諾環(huán)素、多西環(huán)素等8種敏感藥物進(jìn)行治療。