王洪峰，朱長(zhǎng)俊，劉蘭，趙佳茜，黃馨怡

（嘉興學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江嘉興 314001）

樺褐孔菌（Inonotus obliquus）又名白樺茸，具有良好的藥用價(jià)值，常用作各種癌癥、心臟病、糖尿病和0-157大腸桿菌中毒的治療劑，還能抑制HIV病毒和抵抗SARS病毒以及增強(qiáng)免疫力等作用。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)樺褐孔菌的研究較少，主要集中于三萜類(lèi)化學(xué)成分的研究，對(duì)樺褐孔菌的功效成分以及機(jī)理方面卻研究不多，應(yīng)加大對(duì)其的研究力度。對(duì)樺褐孔菌的有機(jī)提取物進(jìn)行生物活性檢測(cè)及成分分析，為這一珍貴藥用菌發(fā)揮其藥理作用提供理論依據(jù)[1]。

1 材料與方法

1.1 材料

樺褐孔菌子實(shí)體，杭州百山祖生物科技有限公司；大腸桿菌（Escherichia coli）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 儀器與試劑

RE－52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠(chǎng)；UV-1100紫外分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；400-MR核磁共振波譜儀，美國(guó)瓦里安公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵，河南省予華儀器有限公司。

石油醚、乙酸乙酯、正丁醇，分析純，華東醫(yī)藥股份有限公司；二甲基亞砜（DMSO），分析純，江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司；無(wú)水乙醇、丙酮，分析純，臨安市青山化工試劑廠(chǎng)；甲醇，分析純，上海聯(lián)試化工試劑有限公司；95%乙醇、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），如吉生物科技有限公司；硅膠，上海盛亞化工有限公司；氘代氯仿（99.8%），上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司。

1.3 樺褐孔菌提取物的制備

將樺褐孔菌子實(shí)體進(jìn)行粉碎，過(guò)200目篩后加入95%的乙醇中浸泡168 h以上得到乙醇浸泡液（0.32g/mL）。取3份1 000 mL乙醇浸泡液經(jīng)過(guò)濾、抽濾、旋蒸后得80 mL左右的乙醇浸膏，加入100 mL去離子水，再分別加入150～200 mL石油醚、乙酸乙酯或正丁醇進(jìn)行萃取，得到3種有機(jī)溶劑的萃取液，在45 ℃下將萃取液旋蒸至50 mL左右，放入45 ℃烘箱中烘干[2-3]。

1.4 樺褐孔菌提取物的生物活性檢測(cè)

1.4.1 抑菌活性檢測(cè)

將提取物溶于DMSO，配成濃度為（50±5）mg/mL的溶液。采用牛津杯法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，加入100 μL樣品液，每組3個(gè)平行，培養(yǎng)觀(guān)察，記錄數(shù)據(jù)。

1.4.2 抗氧化活性檢測(cè)

將提取物用5% DMSO溶解，得到系列濃度（40 μg/mL、80 μg/mL、100 μg/mL、120 μg/mL、160 μg/mL）樣品溶液；DPPH用95%乙醇溶解得到0.10 mmol/L的溶液，按照表1設(shè)置5組試驗(yàn)，每組重復(fù)3次，測(cè)定每組樣品與DPPH溶液反應(yīng)后的吸光度值（AI）及樣品反應(yīng)前的本底吸光度值（AJ），根據(jù)公式1求不同溶劑提取物的DPPH清除率，清除率越高，抗氧化活性越高。

式中，A0代表空白組吸光度，AI代表實(shí)驗(yàn)組吸光度，AJ代表樣品的本底吸光度。

1.5 有機(jī)提取物的柱層析分離提取及產(chǎn)物檢測(cè)

（1）配制洗脫劑。將石油醚、丙酮按照10∶1、8∶1、5∶1、3∶1、1∶1、1∶3 的比例混合配制洗脫劑。（2）裝柱。稱(chēng)15 g硅膠用適量10∶1洗脫劑溶解后裝入柱中，并用10∶1洗脫劑淋洗層析柱，使層析柱緊實(shí)后靜置。（3）上樣。將樣品加入柱中，依次加入不同比例的洗脫劑。（4）收集。用試管收集產(chǎn)物，5 mL/管，2 mL/min；（5）薄層層析（TLC）檢測(cè)。把收集到的樣品點(diǎn)TLC板。（6）對(duì)所得產(chǎn)物繼續(xù)進(jìn)行生物活性檢測(cè)及核磁H譜檢測(cè)[4]。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取結(jié)果

每20g樺褐孔菌粉末可以獲得0.17 g石油醚、0.74 g乙酸乙酯、1.16 g正丁醇提取物。所得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[2]中數(shù)據(jù)相近，結(jié)果良好。

2.2 提取物生物活性檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 抑菌結(jié)果

如圖1所示，石油醚提取物對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸埃希桿菌幾乎沒(méi)有抑菌效果；乙酸乙酯、正丁醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌有很好的抑菌效果，抑菌圈直徑分別為17.5 mm、15.0 mm，但對(duì)大腸埃希桿菌的抑菌效果一般，抑菌圈直徑分別為9.8 mm、9.2 mm。

圖1 樺褐孔菌提取物抑菌結(jié)果

2.2.2 抗氧化活性結(jié)果

如圖2所示，在抗氧化實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)提取物濃度小于100 μg/mL，DPPH自由基的清除率與石油醚、乙酸乙酯、正丁醇提取物濃度呈正相關(guān)；當(dāng)濃度為100 μg/mL時(shí)，三者的清除率分別為15.05%、89.94%、90.10%，因此乙酸乙酯、正丁醇提取物對(duì)DPPH自由基有很好的清除作用。

表1 DPPH清除實(shí)驗(yàn)

2.3 提取物分離產(chǎn)物檢測(cè)

將乙酸乙酯、正丁醇提取物在硅膠柱中進(jìn)行梯度洗脫得到分離產(chǎn)物，對(duì)其進(jìn)行抗氧化及核磁H譜檢測(cè)，核磁H譜檢測(cè)譜圖如圖3所示。

圖2 樺褐孔菌提取物抗氧化性結(jié)果

對(duì)核磁H譜測(cè)定結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果如下。（1）δ：0.66(3H,s)，0.80(3H,s)，0.88(3H,s)，0.96(3H,s)，0.98(3H,s)5個(gè)甲基尖峰，屬于典型的四環(huán)三萜類(lèi)化合物的特征，5.07(1H)；（2）δ：0.64(3H,s)，0.79(3H,s)，0.90(3H,s)，0.97(3H,s)，0.99(3H,s)5個(gè)甲基尖峰，屬于典型的四環(huán)三萜類(lèi)化合物的特征，5.04(2H)，9.43(1H)；由于目標(biāo)產(chǎn)物不是很純或者溶劑中含量較低，導(dǎo)致產(chǎn)物峰不全或雜亂，故只能推斷目標(biāo)產(chǎn)物的部分結(jié)構(gòu)。通過(guò)查閱文獻(xiàn)[5-6]，推測(cè)產(chǎn)物分別為3β-羥基甘遂酸、3-羥基羊毛甾-8,24-二烯-21-醛。

3 結(jié)論

樺褐孔菌的乙酸乙酯、正丁醇提取物具有良好的抗菌、抗氧化生物活性；經(jīng)柱層析分離得到3β-羥基甘遂酸、3-羥基羊毛甾-8,24-二烯-21-醛這2種單體產(chǎn)物。本實(shí)驗(yàn)對(duì)提取物的層析分離效果不是很好，因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行更有效的分離。

圖3 乙酸乙酯、正丁醇提取物在硅膠柱中梯度洗脫得到的分離產(chǎn)物