林清凡，楊維群，溫?fù)P敏，羅彩林

（泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，福建泉州 362011）

大米草是沿海灘涂禾本科植物，于1963年引入我國(guó)并在福建省過度繁殖，對(duì)福建省沿海生態(tài)造成巨大破壞[1]。近年來(lái)研究顯示，大米草含有豐富的黃酮類活性物質(zhì)[2]，而植物黃酮是中草藥抗癌方劑的有效成分[3]，對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖和侵襲轉(zhuǎn)移等過程起顯著作用[4]。羅彩林等[5]已在前期研究中發(fā)現(xiàn)，大米草黃酮（DMC-fla）具有對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的抑制作用，現(xiàn)轉(zhuǎn)入對(duì)食管癌作用的研究。

我國(guó)為食管癌大國(guó)，90%以上為鱗狀細(xì)胞癌，福建省更是其高發(fā)病率、死亡率集中地區(qū)，高于全國(guó)平均水平[6]。食管癌細(xì)胞的高侵襲轉(zhuǎn)移性引發(fā)腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[7]，目前，已有少量研究開始探索植物黃酮對(duì)食管癌細(xì)胞侵襲能力的抑制作用[8-9]。但由于癌轉(zhuǎn)移是一個(gè)涉及多基因、多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控過程，目前在作用的分子水平機(jī)制的解釋上較單薄。但隨RNA-seq和MicroRNA測(cè)序技術(shù)的普及，兩項(xiàng)技術(shù)已在癌與癌旁組織的表達(dá)譜比對(duì)中提供了大量靶點(diǎn)基因與分子病理學(xué)機(jī)制解釋，最近轉(zhuǎn)入到天然產(chǎn)物對(duì)食管癌抑制功效的分子機(jī)制解答中。

因此，本文應(yīng)用RNA-seq與MicroRNA測(cè)序技術(shù)篩選大米草黃酮影響人食管癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)靶點(diǎn)，從轉(zhuǎn)錄組和miRNAs水平上為闡明大米草黃酮影響食管癌轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制提供理論依據(jù)，進(jìn)而探索將大米草黃酮作為食管癌治療藥物的可能性，開發(fā)生態(tài)藥用價(jià)值，實(shí)現(xiàn)“開發(fā)資源、變廢為寶”的入侵物種防治新策略[10]。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

人食管鱗癌細(xì)胞株EC9706，購(gòu)自北納生物細(xì)胞庫(kù)；Mareigel膠，美國(guó)BD公司；Transwell小室，美國(guó)Costar公司；RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清FBS、PBS、胰酶（含EDTA）、RNA提取試劑盒、miRNA提取試劑盒、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和qPCR試劑盒，北京全式金生物有限公司。大米草黃酮提取液由泉州醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校天然產(chǎn)物研究中心制取[11]。K5600分光光度計(jì)，凱奧科技；ABlQ3型熒光定量PCR儀

1.2 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)EC9706細(xì)胞增殖反應(yīng)

對(duì)數(shù)期EC9706接種于96孔板中，每孔5×103個(gè)/100 μL，加入終濃度 4 mg/mL、8 mg/mL、12 mg/mL、16 mg/mL、20 mg/mL劑量的大米草黃酮提取液（DMC-fla），并設(shè)置陰性組與環(huán)磷酰胺（CTX）陽(yáng)性組，37 ℃、5% CO2下培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后，每孔加入10 μL CCK-8，孵育1～2 h后在450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔吸光值A(chǔ)，每個(gè)劑量組設(shè)6個(gè)平行孔，取6孔平均值。

1.3 細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)

EC9706細(xì)胞以1×105個(gè)/孔密度接種于6孔板，常規(guī)培養(yǎng)24 h后待鋪滿板底時(shí)，10 μL槍頭于孔中劃一字型劃痕。實(shí)驗(yàn)組加入終濃度為10 mg/mL的DMC-fla后培養(yǎng)24 h和48 h，顯微鏡下（10×10倍）記錄細(xì)胞遷移后的劃痕寬度并拍照，3組細(xì)胞實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 Transwell穿透測(cè)定細(xì)胞侵襲能力

Mareigel膠用RPMI1640稀釋包被于Transwell小室濾膜上。取對(duì)數(shù)期EC9706細(xì)胞，RPMI1640稀釋，按5×104個(gè)/孔接種于上室，下室為含10%的FBSRPMI1640，常規(guī)培養(yǎng)12 h后，實(shí)驗(yàn)組加入終濃度為10 mg/mL的DMC-fla繼續(xù)培養(yǎng)24 h。去除Mareigel膠和濾膜上方細(xì)胞，DAPI染色，鏡下（10×10倍）計(jì)數(shù)5視野中下室的細(xì)胞平均數(shù)，兩組細(xì)胞實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.5 RNA-seq、MicroRNA測(cè)序及差異基因分析

EC9706細(xì)胞接種于T25培養(yǎng)瓶至匯合度為 80%～90%、10 mg/mL的 DMC-fla處 理 24 h的EC9706細(xì)胞三組與常規(guī)培養(yǎng)24 h三組對(duì)照，刮取細(xì)胞后加入1 mL Trizol，液氮速凍后干冰運(yùn)送至杭州聯(lián)川生物有限公司進(jìn)行RNA-seq。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)預(yù)處理后，選取FDR值＜0.05及差異值＞4或＜-4作為顯著性閾值，并以P值與Q值＜0.05為置信，得到差異表達(dá)候選靶基因。

1.6 Real-time qPCR驗(yàn)證所篩選的靶基因

取DMC-fla處理組與對(duì)照組的EC9706細(xì)胞各3組為樣本，分別提取細(xì)胞總RNA與MicroRNA，分光光度計(jì)檢測(cè)RNA和miRNA純度和濃度，OD260/230在1.75～2.10。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書合成一鏈cDNA為qPCR模板，按照qPCR試劑盒說(shuō)明書于熒光定量PCR儀上對(duì)候選靶基因ITGB6、Serpine1和miR-205進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。采用GAPDH為基因表達(dá)內(nèi)參，U6為MicroRNA表達(dá)參照，SYBRGreen熒光染料法相對(duì)定量，2-ΔΔCT法計(jì)算差異表達(dá)倍數(shù)以驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序所篩選出的候選靶基因，每樣本重復(fù)3次。qPCR反應(yīng)引物設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 靶基因和內(nèi)參基因qPCR引物信息表

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Graphpad Prism 6.0做雙樣本t檢驗(yàn)和雙因素方差檢驗(yàn)等統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)使用±s表示，P＜0.05注*標(biāo)記統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。MeV4.9軟件繪制熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 大米草黃酮對(duì)EC9706細(xì)胞增殖活力的影響

CCK-8結(jié)果如圖1顯示，與對(duì)照組相比，EC9706細(xì)胞活力呈DMC-fla濃度依賴與時(shí)間依賴性的降低。與CTX組相比，在8 mg/mL和24 h處理后出現(xiàn)顯著性差異，選擇10 mg/mL濃度和24 h時(shí)長(zhǎng)，進(jìn)行后續(xù)侵襲力實(shí)驗(yàn)和測(cè)序的細(xì)胞處理。

圖1 EC9706細(xì)胞在大米草黃酮作用下增殖活力的CCK-8結(jié)果

2.2 細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在10 mg/mL DMC-fla作 用24 h和48 h后，EC9706細(xì)胞遷移量明顯小于正常培養(yǎng)的對(duì)照組，具顯著性差異（圖2）。在作用48 h后，細(xì)胞開始出現(xiàn)大片脫離培養(yǎng)基底的現(xiàn)象，受到明顯的生長(zhǎng)抑制。

2.3 大米草黃酮對(duì)EC9706細(xì)胞侵襲力的影響

如表2所示，EC9706細(xì)胞經(jīng)10 mg/mL DMC-fla處理后，體外侵襲Mareigel膠基底能力降低，穿膜細(xì)胞數(shù)量明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明大米草黃酮對(duì)EC9706細(xì)胞侵襲能力具有抑制作用。

圖2 EC9706細(xì)胞在大米草黃酮作用下劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 差異性表達(dá)靶點(diǎn)的篩選

共篩選得到了45個(gè)滿足差異閾值（FDR＜0.05，|logFC|＞2，P值與Q值＜0.05，F(xiàn)RKM＞5）的基因位點(diǎn)，相比對(duì)照（NC）組，在DMC-fla作用下，共有21個(gè)上調(diào)基因，24個(gè)下調(diào)基因（圖3A）。miRNAs共篩選出13個(gè)位點(diǎn)，其中2個(gè)上調(diào)，11個(gè)下調(diào)（圖3B）。結(jié)合目前已有研究中報(bào)道的具有食管癌指標(biāo)性意義的靶基因位點(diǎn)，篩選出ITGB6、SERPINE1和miR-205三個(gè)候選靶基因位點(diǎn)。相比對(duì)照組的FPKM值，DMC-fla組中ITGB6下調(diào)11.1倍，SERPINE1下調(diào)5.3倍，miR-205下調(diào)2.7倍。

表2 10 mg/mL大米草黃酮處理對(duì)EC9706細(xì)胞侵襲能力的影響

2.5 Real-timeqPCR驗(yàn)證關(guān)鍵差異性表達(dá)靶點(diǎn)

如圖4所示，經(jīng)雙因素方差分析，ITGB6、Serpine1和miR-205的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量在對(duì)照組和DMC-fla組的比較中存有顯著性差異，均呈下調(diào)趨勢(shì)，驗(yàn)證了RNA-seq和microRNA測(cè)序的結(jié)果，并說(shuō)明這3個(gè)靶基因的表達(dá)受到了大米草黃酮的抑制，進(jìn)而降低了EC9706細(xì)胞的侵襲力。

圖3 RNA-seq和microRNA測(cè)序后顯著性差異表達(dá)位點(diǎn)的篩選結(jié)果

圖4 qPCR驗(yàn)證挑選的靶基因的差異性表達(dá)

大米草作為入侵物種，對(duì)福建省沿海生態(tài)和海水養(yǎng)殖造成了巨大破壞，然而本課題組研究發(fā)現(xiàn)大米草植物總黃酮的含量豐富，在完善其提取工藝后，大米草黃酮表現(xiàn)出良好的抗氧化性[11]和抑癌性[5]。植物黃酮類化合物是很多中草藥抗癌的有效成分，多種黃酮類物質(zhì)對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲力具有抑制作用，如芹黃素抑制人乳腺癌MCF-7細(xì)胞侵襲[12]，槲皮素降低人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的浸潤(rùn)遷移[13]，三葉青黃酮[8]與姜黃素[9]對(duì)食管癌EC9706細(xì)胞侵襲力具有抑制作用。本研究通過細(xì)胞劃痕愈合和Transwell穿透實(shí)驗(yàn)也表明大米草黃酮對(duì)EC9706細(xì)胞侵襲力的抑制作用。

近年來(lái)，對(duì)食管癌轉(zhuǎn)移的分子病理學(xué)研究逐漸受到重視，RNA-seq和microRNA測(cè)序技術(shù)已被采用于食管癌與癌旁組織的表達(dá)譜比對(duì)中，并提供了大量與食管癌侵襲浸潤(rùn)相關(guān)的、具有臨床學(xué)意義的指標(biāo)性靶位點(diǎn)，其中ITGB6[14]、Serpine1[15]和miR-205[16]等的高表達(dá)與食管癌細(xì)胞的侵襲力呈正相關(guān)。本研究中發(fā)現(xiàn)，食管癌EC9706細(xì)胞經(jīng)大米草黃酮處理后，細(xì)胞內(nèi)ITGB6、Serpine1和miR-205的表達(dá)呈明顯下調(diào)趨勢(shì)，與其侵襲力下降相關(guān)聯(lián)。目前已被證實(shí)的黃酮抑癌侵襲力作用機(jī)制為三葉青黃酮下調(diào)Notch1[8]和姜黃素下調(diào)Est-1、MMP9[9]的表達(dá)，而下調(diào)ITGB6、Serpine1和miR-205是否為大米草黃酮抑癌侵襲力的作用機(jī)制，仍有待進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

3 結(jié)論

轉(zhuǎn)錄組和miRNAs數(shù)據(jù)顯示在大米草黃酮作用下，EC9706細(xì)胞ITGB6、Serpine1和miR-205的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量被顯著地下調(diào)降低，暗示著這3個(gè)靶點(diǎn)是大米草黃酮抑制食管癌細(xì)胞侵襲力的潛在作用靶點(diǎn)。但目前還未將轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與miRNAs表達(dá)譜進(jìn)行聯(lián)合分析，未來(lái)將進(jìn)一步進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘分析，力圖找到miRNA作用關(guān)鍵靶基因mRNA從而調(diào)控細(xì)胞遷移的作用通路，明確大米草黃酮抑癌細(xì)胞遷移的分子機(jī)制，為大米草的藥用價(jià)值開發(fā)和變害為寶的防治策略提供理論依據(jù)。