張歡 梁波 王雄 鄭德泉

乳腺癌在女性惡性腫瘤中最為常見，其中三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）即孕激素受體（progesterone receptor，PR）、雌激素受體（estrogen receptor，ER）和人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor-2，HER2）表達(dá)均為陰性的乳腺癌，雖然僅占到所有乳腺癌病理類型的10%～20.8%，但其侵襲早、轉(zhuǎn)移快、病死率高的特點(diǎn)已經(jīng)成為乳腺癌診斷、治療的難點(diǎn)和研究熱點(diǎn)[1]。由于TNBC 缺乏特異性分子標(biāo)志物，大多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已是中晚期，治療效果不理想，致使該病5年生存率不足30%[2]。因此，尋找新型、高效、準(zhǔn)確的分子標(biāo)記物，盡可能在早期對疾病進(jìn)行干預(yù)治療，有可能成為改善患者預(yù)后、延長生存期的關(guān)鍵。

MicroRNA（miRNA）屬于內(nèi)源性非編碼RNA，目前已知miRNA 約1 000 種，約50%的miRNA 位于與腫瘤相關(guān)的脆弱性位點(diǎn)或區(qū)域，提示miRNA 可能與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[3，4]。已有研究證實(shí)[5，6]，miRNA-455-3p 與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，但對TNBC 疾病發(fā)生發(fā)展的影響卻少有報(bào)道。本研究通過探討血清miRNA-455-3p 水平在TNBC 患者中的臨床意義，并分析其與臨床預(yù)后的關(guān)系，為臨床診斷評估提供參考。

1 材料與方法

1.1 一般資料選取2015 年5 月～2017 年3 月我院胸外科經(jīng)病理學(xué)診斷證實(shí)為TNBC 患者80 例為TNBC 組，年齡30～75 歲，平均（56.86±12.48）歲；選取同期我院體檢中心志愿者80 例為對照組，年齡30～75 歲，平均（57.21±13.52）歲。兩組年齡無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。觀察組腫瘤分型：浸潤性導(dǎo)管癌55 例，浸潤性小葉癌17 例，其他類型乳腺癌8例。TNM 分期：Ⅰ～Ⅱ期32 例，Ⅲ期48 例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移56 例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移24 例。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器RNA 提取試劑購自Invitrogen Ambion 公司；SYBR Green 熒光染料試劑盒購自莫賽飛公司；H2O2水（Sigma 公司）；5804R 型高速冷凍離心機(jī)購自Eppendorf 公司；FTC3000 型RT-PCR 儀購自Funglyn Biotech 公司；9UV752 型紫外可見光光度計(jì)（上海佑科公司）。

1.3 Real-time PCR 檢測miRNA-455-3p 血清水平miRNA-455-3p 引物由衡陽瀟湘博睿科技服務(wù)有限公司合成，檢測兩組患者血清中miRNA-455-3p的表達(dá)。miRNA-455-3p 引物序列參考NCBI Gene數(shù) 據(jù) 庫，miRNA-455-3p 引 物：F：5'-CGTCGAAGA AGGGCAAGTAG-3'，R：5'-CACCATTCCAAGCAC AACAC-3'；內(nèi)參U6 引物：F：5'-CTCGCTTCGGCAG CACA-3'，R：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。按照采買的RNA 提取試劑盒說明書操作，先提取血清總RNA，鑒定總RNA 濃度（紫外分光度法），5min內(nèi)加熱至70℃，冷卻2min，離心后依次加入Buffer、RNasin 及M-MLV，混勻后25℃溫浴10min，42℃溫浴50min，95℃加熱5min，終止反應(yīng)，可得20μl cDNA。取1μl cDNA 模板，miRNA-455-3p 上下游引物各加入0.5μl，加入到10μl SYBR GREEN 中，最后用ddH2O 補(bǔ)齊至20μl 進(jìn)行PCR 循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后經(jīng)95 ℃ 10min，60 ℃ 20s，72 ℃ 30s，4 ℃5min，循環(huán)40 次，每個(gè)基因樣品行3 個(gè)孔平行試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用2－△△Ct 法分析。

1.4 研究方法由本科室主治醫(yī)師詳細(xì)詢問病史，完整收集患者臨床資料，對比TNBC 組和對照組患者血清miRNA-455-3p 表達(dá)水平；采用ROC 曲線分析血清miRNA-455-3p 水平對TNBC 的診斷效應(yīng)及miRNA-455-3p 截?cái)嘀?；分析術(shù)前血清中miRNA-455-3p 表達(dá)水平與TNBC 患者臨床病理學(xué)之間關(guān)系，并記錄患者術(shù)后3 年內(nèi)復(fù)發(fā)例數(shù)及死亡例數(shù)，分析血清中miRNA-455-3p 異常表達(dá)是否為TNBC 患者術(shù)后3 年內(nèi)復(fù)發(fā)及死亡的危險(xiǎn)因素。末次隨訪日期為2020 年4 月，中位隨訪時(shí)間為36.2個(gè)月。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料以表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)；Kaplan-Meier 法計(jì)算TNBC患者累計(jì)生存時(shí)間，Log-rank 檢驗(yàn)進(jìn)行生存分析，根據(jù)Cox 風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行單因素和多因素分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者血清miRNA-455-3p 表達(dá)水平情況TNBC 組患者血清miRNA-455-3p 相對表達(dá)量為（1.53±0.34），低于對照組（6.31±1.03），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.2 血清miRNA-455-3p 對TNBC 的診斷效應(yīng)分析miRNA-455-3p 曲線下面積為0.746，95%CI（0.652，0.779），Youden 指數(shù)為0.433，截?cái)嘀禐?.06（高于截?cái)嘀禐楦弑磉_(dá)，低于截?cái)嘀祫t為低表達(dá)），miRNA-455-3p 對TNBC 診斷的敏感度和特異度分別為72.4%和68.9%，見圖1。

圖1 血清miRNA-455-3p 表達(dá)對TNBC 診斷的ROC 曲線

2.3 血清miRNA-455-3p 表達(dá)水平與TNBC 的臨床病理學(xué)分析臨床病理學(xué)分析結(jié)果顯示，血清miRNA-455-3p 表達(dá)與TNM 分期、血管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及術(shù)后3 年內(nèi)復(fù)發(fā)有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而與患者年齡、腫瘤類型及是否絕經(jīng)無關(guān)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 血清miRNA-455-3p 表達(dá)水平與TNBC 的臨床病理學(xué)分析

2.4 血清miRNA-455-3p 表達(dá)與TNBC 術(shù)后復(fù)發(fā)和預(yù)后的關(guān)系經(jīng)隨訪，TNBC 患者術(shù)后3 年內(nèi)復(fù)發(fā)58 例，死亡45 例，其中血清miRNA-455-3p 高表達(dá)復(fù)發(fā)20 例，死亡9 例，復(fù)發(fā)率及死亡率分別為25.00%和11.25%，低表達(dá)復(fù)發(fā)38 例，死亡36 例，復(fù)發(fā)率及死亡率分別為47.50%和45.00%。與血清miRNA-455-3p 高表達(dá)患者比較，血清miRNA-455-3p 低表達(dá)患者復(fù)發(fā)率及死亡率均較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Cox 單因素回歸分析結(jié)果：TNM 分期、腫瘤有血管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及血miRNA-455-3p 低表達(dá)是影響TNBC 患者術(shù)后3 年內(nèi)復(fù)發(fā)和總體生存率的危險(xiǎn)因素（P＜0.05）；Cox 多因素回歸分析結(jié)果：腫瘤有血管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及血miRNA-455-3p 低表達(dá)是預(yù)測TNBC 患者術(shù)后3 年內(nèi)復(fù)發(fā)和總體生存率的危險(xiǎn)因素（P＜0.05），且血清miRNA-455-3p 低表達(dá)是TNBC 患者術(shù)后3年內(nèi)復(fù)發(fā)和死亡率升高的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05），見表2、3。

表2 TNBC 術(shù)后3 年內(nèi)復(fù)發(fā)及總體生存預(yù)估的單因素分析

表3 TNBC 術(shù)后3 年內(nèi)復(fù)發(fā)及總體生存預(yù)估的多因素分析

3 討論

TNBC 相對其他乳腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)率及死亡率均較高，嚴(yán)重威脅女性健康，是乳腺癌患者死亡的主要因素之一[7]。有研究表明[8]，TNBC 異質(zhì)性較強(qiáng)，臨床亞型較多，將其視為一種疾病已不符合精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的概念，稱之為“一類疾病”更為準(zhǔn)確。由于其亞型眾多，發(fā)病機(jī)制各不相同，很難找到一種理想的分子標(biāo)記物對TNBC 進(jìn)行早期診斷及預(yù)后評估。因此，尋找新的高效、穩(wěn)定的TNBC 評估標(biāo)記物仍是亟待解決的熱點(diǎn)問題。miRNAs 在外周血中的表達(dá)具有極強(qiáng)的穩(wěn)定性，已成為目前臨床尋找高效疾病分子標(biāo)記物的新方向。雖然外周血中miRNA 的具體來源尚無定論，但miRNAs 的部分調(diào)控作用已進(jìn)行了大量而深入的研究，目前已在多種炎癥、惡性腫瘤及自身免疫性疾病的診斷和預(yù)測中顯示了獨(dú)特的應(yīng)用價(jià)值[9～11]。周冬冬等[12]研究發(fā)現(xiàn)，老年TNBC 患者血清中miRNA-21、miRNA-200a、miRNA -200b 均出現(xiàn)異常表達(dá)，其中miRNA-21、miRNA-200a 明顯升高，miR-200b 水平明顯下降，并且其變化趨勢與腫瘤的分期、分型及轉(zhuǎn)移情況密切相關(guān)，在一定程度上可預(yù)測TNBC 術(shù)后轉(zhuǎn)歸情況。近些年由于科學(xué)檢測技術(shù)的突飛猛進(jìn)，miRNAs 芯片技術(shù)篩選已然成熟，雖然尚未闡述清楚差異miRNAs 在腫瘤發(fā)生及發(fā)展中的作用機(jī)制，但已經(jīng)為腫瘤發(fā)病機(jī)制的精準(zhǔn)研究提供了新方向[13]。

miRNA-455-3p 是染色體脆弱性位點(diǎn)9q32 區(qū)域唯一一個(gè)miRNA，已證實(shí)其與乳腺癌、宮頸癌及胃癌的發(fā)生密切相關(guān)[6，14，15]，但miRNA-455-3p 對于TNBC 的臨床意義卻少有報(bào)道。本研究首先對比TNBC 與健康志愿者血清中miRNA-455-3 表達(dá)水平，結(jié)果證實(shí)TNBC 患者血清中miRNA-455-3為低水平表達(dá)，說明低水平miRNA-455-3 可能是促進(jìn)腫瘤發(fā)生的重要因素。應(yīng)用ROC 曲線對miRNA-455-3 的診斷效能進(jìn)行分析，曲線下面積為0.746，雖然未能達(dá)到0.9 以上，但足夠說明miRNA-455-3 對TNBC 具有較高的診斷準(zhǔn)確性。從臨床病理學(xué)角度分析，TNBC 患者血清miRNA-455-3 的低表達(dá)可能與TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管侵犯程度及3 年內(nèi)復(fù)發(fā)有關(guān)，因此，血清miRNA-455-3 表達(dá)水平對于TNBC 臨床診斷及疾病進(jìn)程分析具有一定的參考價(jià)值。在后續(xù)的研究中，我們通過對患者持續(xù)3 年隨訪，并記錄患者復(fù)發(fā)率及死亡率，并采用單因素Cox 回歸分析，發(fā)現(xiàn)TNM 分期、腫瘤有血管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及血miRNA-455-3p 低表達(dá)是影響TNBC 患者術(shù)后3 年內(nèi)復(fù)發(fā)和總體生存率的危險(xiǎn)因素，但上述結(jié)果中，TNM 分期與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況具有相互重疊性，難以進(jìn)行準(zhǔn)確的多因素分析，故而在多因素分析中去除由“多條件”共同制定的TNM 分期。多因素Cox回歸分析證實(shí)腫瘤有血管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及血miRNA-455-3p 低表達(dá)是預(yù)測TNBC 患者術(shù)后3 年內(nèi)復(fù)發(fā)和總體生存率的危險(xiǎn)因素。劉益娟等[5]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-455-3p 可能通過阻斷PI3K/AKT信號通路抑制腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲。TNBC 患者血清miRNA-455-3 呈低表達(dá)，可能難以起到阻斷PI3K/AKT 信號通路的作用，可能使PI3K/AKT 通過直接磷酸化多種轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、抑制凋亡并增強(qiáng)細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力[16]。TNBC的臨床特點(diǎn)也是易轉(zhuǎn)移、易復(fù)發(fā)，miRNA-455-3低表達(dá)后對腫瘤細(xì)胞的影響與TNBC 相同，因此miRNA-455-3 低表達(dá)可能是該病發(fā)生及發(fā)展的重要因素之一。

綜上所述，TNBC 患者血清miRNA-455-3 低表達(dá)提示腫瘤可能存在侵襲、轉(zhuǎn)移，并且與預(yù)后顯著相關(guān)，是影響TNBC 患者術(shù)后復(fù)發(fā)率及生存率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。