張建業(yè)　殷蕊　孫桂清　于清海　劉玉峰　何忠偉　宮春光

摘 要：通過液態(tài)拮抗培養(yǎng)法，研究了在鹽度30‰條件下1×104、1×105和1×106 cfu/mL濃度的地衣芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、枯草芽孢桿菌（B.licheniformis）、凝結(jié)芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）、多粘類芽孢桿菌（B.coagulans）和側(cè)孢短芽孢桿菌（Brevibacillus laterosporu）對混合弧菌（Vibrio）的抑制作用，結(jié)果顯示，5種芽孢桿菌對混合弧菌均具有顯著的抑制作用（P<0.05），其中，枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌的抑制效果最佳。

關(guān)鍵詞：芽孢桿菌;弧菌;抑制作用

近年來，牙鲆（Paralichthys olivaceus）、大菱鲆（Scophthalmus maximus）和半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）等海水魚類的養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅猛，而隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷增大，養(yǎng)殖對象的病害問題也愈發(fā)嚴(yán)重，給養(yǎng)殖戶造成了巨大損失[1]。多數(shù)弧菌作為條件致病菌廣泛存在于海水養(yǎng)殖環(huán)境中，常常造成養(yǎng)殖對象病害頻發(fā)，因此，有效降低養(yǎng)殖環(huán)境中的弧菌密度對減少病害、保障水產(chǎn)品安全意義重大。水體消毒劑如：含氯消毒劑、酚類消毒劑等的過度使用會對水產(chǎn)動物本身產(chǎn)生損傷[2]，長時間使用抗生素容易產(chǎn)生耐藥性，同時抗生素還可通過水產(chǎn)品危害到人類健康[3]，減少或禁止化學(xué)試劑及抗生素的使用已經(jīng)成為水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)的主要趨勢[4]。針對此情況，采用益生菌制劑來抑制病原菌、凈化養(yǎng)殖水體，已成為解決此類問題的重要手段之一[5]。芽孢桿菌是一類廣鹽性菌群，生長受鹽度影響較小，在海淡水中均可生長繁殖，能夠應(yīng)用于海水養(yǎng)殖[6]。近年來，越來越多的研究表明芽孢桿菌可以解決長期或過量使用抗生素對水生動物造成危害的問題，在生態(tài)漁業(yè)和藥物控制上，開發(fā)潛力巨大[7]。在海水養(yǎng)殖方面，對于不同芽孢桿菌對弧菌抑制效果的研究較少，選用品種和使用方法尚不清晰，針對這種情況，本實驗選取實際生產(chǎn)中常用的5種芽孢桿菌，在同一海水環(huán)境下，探究其對混合弧菌的抑菌效果，為海水養(yǎng)殖過程中使用芽孢桿菌控制弧菌提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 實驗用菌

實驗使用的巨弧菌（vibrio giantis）、嗜環(huán)弧菌（Vibrio cyclitrophicus）、弗尼斯弧菌（Vibrio furnissii）和溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）分離自患病牙鲆;地衣芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、枯草芽孢桿菌（B.licheniformis）、多粘芽孢桿菌（B.coagulans）、凝結(jié)芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）和側(cè)孢短芽孢桿菌（Brevibacillus laterosporu）來自河北農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院實驗室，芽孢桿菌使用前，將菌粉、紅糖、無菌水以1∶0.5∶20的比例充氣活化3 h，血球計數(shù)板計數(shù)。

1.2 實驗方法

實驗采用靜水方法，不充氣;在1 000 mL燒杯內(nèi)加入鹽度33‰的人工配制海水900 mL，同時加入100 mL的牛肉膏蛋白胨營養(yǎng)液。每組分別添加枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、多粘類芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌和側(cè)孢短芽孢桿菌，分別配制成1×104、1×105、1×106 cfu/mL的濃度梯度;添加巨弧菌、嗜環(huán)弧菌、弗尼斯弧菌和溶藻弧菌（1∶1∶1∶1）的混合弧菌，配制成5.5×103 cfu/mL濃度;對照組不添加芽孢桿菌。實驗設(shè)置3個平行，在室溫條件下進(jìn)行（17～25℃）。

實驗為期7 d，每隔24 h采樣，涂TCBS平板30℃培養(yǎng)24～30 h后進(jìn)行弧菌菌落計數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均以平均值表示，采用Excel進(jìn)行統(tǒng)計分析和SPSS 17.0分析軟件進(jìn)行顯著性差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌對弧菌的抑制作用

不同濃度的枯草芽孢桿菌對混合弧菌的抑制效果見圖1。

實驗結(jié)果表明，1×104 cfu/mL、1×105 cfu/mL和1×106 cfu/mL濃度組的枯草芽孢桿菌對弧菌均有明顯抑制作用，弧菌濃度均顯著低于對照組（P<0.05）;3個濃度組之間沒有顯著差異。

2.2 地衣芽孢桿菌對弧菌的抑制作用

不同濃度的地衣芽孢桿菌對混合弧菌的抑制效果見圖2。

實驗結(jié)果表明，1×104 cfu/mL、1×105 cfu/mL和1×106 cfu/mL濃度組的枯草芽孢桿菌對弧菌均有明顯抑制作用，弧菌濃度均顯著低于對照組（P<0.05）;3個濃度組之間沒有顯著差異。

2.3 多粘類芽孢桿菌對弧菌的抑制作用

不同濃度的多粘類芽孢桿菌對混合弧菌的抑制效果見圖3。

實驗結(jié)果表明，1×104 cfu/mL、1×105 cfu/mL和1×106 cfu/mL濃度組的枯草芽孢桿菌對弧菌均有明顯抑制作用，弧菌濃度均顯著低于對照組（P<0.05）; 106 cfu/mL濃度組的弧菌濃度顯著低于104 cfu/mL、105 cfu/mL組（P<0.05）。

2.4 凝結(jié)芽孢桿菌對弧菌的抑制作用

不同濃度的凝結(jié)芽孢桿菌對混合弧菌的抑制效果見圖4。

實驗結(jié)果表明，1×104 cfu/mL、1×105 cfu/mL和1×106 cfu/mL濃度組的枯草芽孢桿菌對弧菌均有明顯抑制作用，弧菌濃度均顯著低于對照組（P<0.05）;3個濃度組之間沒有顯著差異。

2.5 側(cè)孢短芽孢桿菌對弧菌的抑制作用

不同濃度的側(cè)孢短芽孢桿菌對混合弧菌的抑制效果見圖5。

實驗結(jié)果表明，1×104 cfu/mL、1×105 cfu/mL和1×106 cfu/mL濃度組的枯草芽孢桿菌對弧菌均有明顯抑制作用，弧菌濃度均顯著低于對照組（P<0.05）;3個濃度組之間沒有顯著差異。

2.6 五種芽孢桿菌的抑菌能力比較

不同濃度的5種芽孢桿菌對混合弧菌的抑制效果見圖6。

由圖6可知， 104 cfu/mL濃度組，枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌組的弧菌濃度均顯著低于多粘類芽孢桿菌和側(cè)孢短芽孢桿菌組（P<0.05）;105 cfu/mL濃度組，枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌組的弧菌濃度顯著低于多粘類芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌和側(cè)孢短芽孢桿菌組（P<0.05）;106 cfu/mL濃度組，枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和多粘芽孢桿菌組的弧菌濃度均顯著低于凝結(jié)芽孢桿菌和側(cè)孢短芽孢桿菌組（P<0.05）。

3 討論

芽孢桿菌在生長的過程中會產(chǎn)生脂肽類化合物、聚酮類化合物等多種物質(zhì)，這些抗菌活性物質(zhì)通過胞膜攻擊作用、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、線粒體攻擊作用、抑制蛋白質(zhì)及細(xì)胞壁合成等作用方式抑制弧菌生長。向亞萍等[8]研究發(fā)現(xiàn)55株芽孢桿菌以及脂肽類抗生素對3個病原菌都具有不同程度的抑菌活性，并提出芽孢桿菌脂肽類抗生素具有多樣性并且是抑制病原菌的主要因子。王芳等[9]通過大孔吸附樹脂法對芽孢桿菌能產(chǎn)出抑菌成分進(jìn)行提純，得到一系列環(huán)肽類抗菌化合物。

本實驗結(jié)果顯示，枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌表現(xiàn)出較強的抑制弧菌能力，這可能與其增殖能力較強以及分泌的抗菌活性物質(zhì)更為有效有關(guān)。閆茂倉等[10]采用與本實驗相似的方法發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌對泥蚶養(yǎng)殖底泥中的弧菌有抑制作用，5×103 cfu/mL和1×104 cfu/mL濃度組弧菌總數(shù)顯著低于1×103 cfu/mL組（P<0.05）;黃汝添等[11]發(fā)現(xiàn) 4×106 cfu/mL枯草芽孢桿菌對溶藻弧菌的生長有明顯的抑制效果。本實驗結(jié)果與他們一致。目前，關(guān)于多粘類芽孢桿菌、凝結(jié)枯草芽孢桿菌和側(cè)孢短芽孢桿菌對弧菌抑制作用的報道較少，而本實驗表明，這3株芽孢桿菌對弧菌也有較強的抑制作用，可以考慮在實際生產(chǎn)中使用。

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（收稿日期：2020-10-10）

基金項目：基金項目：河北省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系特色海產(chǎn)品創(chuàng)新團(tuán)隊（編號：HBCT2018170206，HBCT2018170203）。

作者簡介：張建業(yè)（1994.5-），男，碩士研究生，研究方向：水產(chǎn)動物病害。E-mail：491885334@qq.com。

通信作者：宮春光（1971.4-），男，副教授，主要從事水產(chǎn)動物病害的教學(xué)與研究。E-mail：gongcg2005@163.com。