李建功，麥喆钘，李雪山△，羅川晉，李俊哲

(1. 中山市中醫(yī)院內(nèi)一科，廣東 中山 528400； 2. 廣州中醫(yī)藥大學，廣州 510405)

心肌缺血再灌注損傷是指心肌組織在較長時間心肌缺血后恢復血流灌注，反而出現(xiàn)比灌注前更明顯、更嚴重的功能損傷和組織障礙[1-2]。目前，該病的防治策略主要包括淺低溫治療、補充抗氧化劑等[3]。中醫(yī)藥防治心肌缺血再灌注損傷是當今的研究重點[4-6]。

黃蛭口服液的功效為活血逐瘀、行氣化濁，在臨床常被用于高血壓、高血脂癥、冠心病等治療[7-8]。黃蛭口服液由大黃、水蛭、牛蒡子組成[9-10]。研究顯示，黃蛭口服液能顯著上調(diào)單核巨噬細胞ABCA1的水平[11]，明顯減少心律失常的發(fā)生率，減少血清丙二醇的產(chǎn)生，增加超氧化物歧化酶的含量[12]，在降低患者超敏C反應蛋白、低密度脂蛋白、腦鈉肽水平方面有一定的輔助作用[13-14]。黃蛭口服液作為中成藥制劑，具有“多成分、多靶點、多途徑”的特點。但目前大多研究僅停留于藥物對個體和個別分子的影響，其治療心肌缺血再灌注損傷的有效活性成分及作用機制尚不明確。而對于黃蛭口服液，仍未有任何相關網(wǎng)絡藥理學研究。本研究采用網(wǎng)絡藥理學方法，分析黃蛭口服液的化學成分、作用靶標、信號通路，揭示黃蛭口服液的多靶標、多通路協(xié)同作用，從而發(fā)現(xiàn)新的治療靶點和通路，為臨床治療心肌缺血性再灌注損傷提供新思路。

1 資料與方法

1.1 藥物化學成分和活性成分的獲取

通過檢索中國系統(tǒng)藥理學平臺(http://lsp.nwu.edu.cn/，TCMSP)獲取大黃和牛蒡子的化學成分，通過檢索文獻資料獲取水蛭的化學成分，再于TCMSP平臺檢索所有化學成分的信息，包括分子名(Molecule Name)、分子量(MW)、口服生物利用度(OB)、血腦屏障(BBB)、類藥性(DL)等。結合毒藥物動力學評價標準，設置OB值≥40%和DL值≥0.18為篩選條件[15]，從所有化學成分中篩選出活性成分。

1.2 黃蛭口服液活性成分預測靶標的獲取

將所有活性成分的3D結構圖通過軟件Chembiodraw Ultra 12.0繪制出來，并上傳至DRAR-CPI服務器(http://cpi.bio-x.cn/drar/)?；诜聪蚍肿訉釉恚玫礁骰钚猿煞峙c所有蛋白的結合親和力分數(shù)(Z-score)。本團隊選取分數(shù)小于-0.5的蛋白作為黃蛭口服液的預測靶標。并通過UniprotKB數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)中獲取各預測靶標的基因符號及其Uniprot ID。

1.3 心肌缺血再灌注損傷相關靶標基因獲取

以“myocardial reperfusion injury”和“myocardial ischemia reperfusion injury”為關鍵詞分別從Genecards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)和DisGeNET數(shù)據(jù)庫(http://www.disgenet.org/)中檢索出與心肌缺血再灌注損傷相關的蛋白，結合2個數(shù)據(jù)庫的檢索結果作為本次研究的疾病靶標。

1.4 活性成分-療效靶標網(wǎng)絡構建與分析

取活性成分預測靶標與疾病靶標兩者的交集，作為黃蛭口服液治療心肌缺血再灌注的療效靶標。將療效靶標及其對應的活性成分導入軟件Cytoscape 3.5.1，構建出活性成分-療效靶標網(wǎng)絡。

1.5 療效靶標相互作用網(wǎng)絡構建與分析

將所有療效靶標的Uniprot ID導入String數(shù)據(jù)庫，限定物種條件為“Homo sapiens”，獲取療效靶標之間的蛋白相互作用關系(Protein-protein interactions，PPI)，并利用軟件Cytoscape 3.5.1繪制出PPI網(wǎng)絡圖，并使用NetworkAnalyzer工具對網(wǎng)絡圖進行統(tǒng)計，得出各療效靶標的degree值(連接度)，即各靶標可相互作用的靶標數(shù)。挑選出degree值最大的5個療效靶標作為核心靶標。

1.6 分子對接與分析

將上述5個核心靶標導入System Dock Web Site 服務器(http://systemsdock.unit.oist.jp/iddp/home/index)，按照服務器原始參數(shù)的設定，進行核心靶標與活性成分之間的分子對接，得出對接評分(Docking score)，并通過柱狀圖的方式展示結果。通過該評分評價成分與和核心靶標之間的結合潛力。

1.7 分子功能與通路分析

利用DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)對療效靶標進行基因本體(Gene ontology，GO)富集分析和基于京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)的通路富集分析，再選取GO分析結果中的分子功能(Molecular Function)部分和KEGG分析結果中通路(KEGG PATHWAY)部分進行討論。篩選出P值小于0.05和富集基因數(shù)較大的前20條通路與分子功能。篩選結果通過OmicShare網(wǎng)站(http://www.omicshare.com/)繪制的高級氣泡圖展示。

1.8 藥物-活性成分-潛在靶標-通路網(wǎng)絡構建

通過文獻資料，從20條通路中再篩選出與心肌缺血再灌注相關的通路作為重要通路。再將與重要通路對應的療效靶標以及作用于療效靶標的活性成分，導入Cytoscape 3.5.1繪制“藥物-活性成分-療效靶標-重要通路”網(wǎng)絡圖，閱圖分析黃蛭口服液的治療機制及特點。

2 結果

2.1 黃蛭口服液的活性成分

按照步驟1.1本團隊篩選到13個活性成分，其中大黃有5個，水蛭有5個，牛蒡子有3個，包括大黃酸(rhein)、決明內(nèi)酯(Toralactone)、水蛭素(hirudin)、森林山蛭素(haemadin)、牛蒡子苷(arctiin)。

2.2 心肌缺血再灌注損傷潛在作用靶標預測

表1示，按照步驟1.2及1.3本研究共獲得活性成分預測靶標126個和疾病靶標1156個，最后得到療效靶標76個。

2.3 成分-靶標關系網(wǎng)絡的構建

圖1示，按照步驟1.4繪制出活性成分-療效靶標網(wǎng)絡圖。圖1共含有節(jié)點86個，包括13個八邊形的活性成分節(jié)點(內(nèi)圈)以及73個橢圓形的療效靶標節(jié)點(外圈)；邊線120條，代表13個活性成分與73個療效靶標之間共有120種作用關系。由此可見，黃蛭口服液治療心肌缺血再灌注損傷是通過復雜網(wǎng)絡關系而非簡單的單一成分作用單一靶標來發(fā)揮作用的。

圖1 活性成分-療效靶標網(wǎng)絡

表1 黃蛭口服液活性成分表

2.4 潛在靶標相互作用網(wǎng)絡構建

圖2示，按照步驟1.5得到73 個療效靶標之間的PPI網(wǎng)絡圖。由此可見，73個療效靶標之間有著復雜的關聯(lián)，這提示黃蛭口服液不僅是因為作用于多個靶標發(fā)揮治療作用，還可因為多個療效靶標之間的相互調(diào)節(jié)影響。同時本團隊發(fā)現(xiàn)，在黃蛭口服液治療心肌缺血再灌注損傷中發(fā)揮較大作用的5個核心靶標分別是ALB、AKT1、TNF、CASP3、JUN。

圖2 療效靶標相互作用網(wǎng)絡

2.5 分子對接

圖3示，按照步驟1.5對活性成分和核心靶標進行分子對接，得到對接評分結果。Docking score值大于7.0的成分有15個(23.1%)，Docking score值在5.0到7.0之間的有24個(36.9%)，在4.25到5.0之間的成分有17個(26.2%)，而Docking score值小于4.25 的成分僅有9個(13.8%)。綜上，黃蛭口服液的活性成分與核心靶標具有良好的結合活性。

圖3 分子對接結果

2.6 GO分類富集分析和KEGG通路富集分析

圖4、5示，按照步驟1.7得到GO分析和KEGG分析結果，其中P<0.05且富集靶標較多的分子功能有protein binding、enzyme binding等；P<0.05且富集靶標較多的生物通路有PI3K/AKT、TNF、p38MAPK、HIF-1等信號通路。

圖4 潛在作用靶標的MF分析

2.7 藥物-活性成分-潛在靶標-通路網(wǎng)絡構建

圖6示，按照步驟1.8本研究篩選到5條重要通路，分別是HIF-1 pathway、p38MAPK pathway、TNF pathway、PI3K/AKT pathway和Apoptosis。據(jù)此繪制出藥物-活性成分-療效靶標-重要通路網(wǎng)絡圖，其中六邊形節(jié)點代表重要通路，圓形節(jié)點代表療效靶標，三角形節(jié)點代表活性成分，矩形節(jié)點則為藥物。由圖可知，黃蛭口服液治療心肌缺血再灌注損傷是利用多成分作用于多靶點，影響多通路來發(fā)揮作用的。

圖6 “藥物-活性成分-療效靶標-重要通路”多維網(wǎng)絡關系圖

3 討論

心肌缺血再灌注損傷是常見的心血管疾病，需要引起臨床醫(yī)生的重視。研究發(fā)現(xiàn)，黃蛭口服液可降低腦鈉肽前體，同時還可提高PCI術后左室射血分數(shù)，是治療再灌注損傷的首選藥物之一[16-17]。本研究利用網(wǎng)絡藥理學原理，通過對各個數(shù)據(jù)庫的挖掘和檢索，構建出“藥物-活性成分-療效靶標-重要通路”網(wǎng)絡，對黃蛭口服液治療心肌缺血再灌注損傷的作用機制進行了初步探討。

研究發(fā)現(xiàn)，黃蛭口服液主要通過13個活性成分發(fā)揮治療作用，包括大黃酸(rhein)、水蛭素(hirudin)、牛蒡子苷(arctiin)等。現(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)，大黃酸具有清除活性氧且明顯減少心肌缺血后產(chǎn)生毒物對心肌細胞的損害[18]。林冠宇[19]等研究發(fā)現(xiàn)，中低劑量的水蛭素可以通過增加VEGF蛋白合成以激活Notch通路，促進人微血管內(nèi)皮細胞增殖和微血管再生，加快缺血損害組織的恢復。Zhang[20]等發(fā)現(xiàn)，牛蒡子苷可抑制脂多糖誘導中性粒細胞、淋巴細胞、巨噬細胞和白蛋白等分泌過程，減少炎癥發(fā)生，降低炎癥對缺血心肌細胞的損害。

通過檢索這73個療效靶標的相互作用關系，結合文獻閱讀，本研究認為AKT1、TNF、JUN等靶標在治療心肌缺血再灌注損傷中發(fā)揮最廣泛的作用。李東野[21]等研究發(fā)現(xiàn)，AKT1基因可以通過促進抑凋亡基因Bcl-2的表達，同時抑制促凋亡基因Bax的表達，通過兩方面的作用抑制心肌細胞凋亡。還有研究認為，抑制JUN基因的轉(zhuǎn)錄也可以阻斷細胞凋亡反應的發(fā)生[22]。再者減少TNF-α的釋放也可以通過抑制細胞凋亡有效減輕心肌缺血再灌注損傷[23]。因此我們認為，黃蛭口服液主要是通過抑制心肌細胞凋亡產(chǎn)生療效，具體可能是減少PCI術后活性氧等對有毒害作用物質(zhì)的產(chǎn)生。核心靶標與13個活性成分分子對接結果顯示兩者結合活性良好，充分說明本研究采用的方法學具有較好的科學性，結果與客觀事實比較接近，故此基礎上進行構建網(wǎng)絡并分析，能為臨床使用或進一步科學研究提供有價值的指導。

GO分析結果提示，黃蛭口服液可能通過影響蛋白結合功能起到治療心肌缺血再灌注損傷的作用。脂聯(lián)素受體結合蛋白是脂聯(lián)素受體1 的一個關鍵結合蛋白[24]，兩者的結合可以介導脂聯(lián)素在多種細胞中產(chǎn)生信號傳導作用，促進脂聯(lián)素對缺血再灌注損傷心肌的保護[25-26]，所以黃蛭口服液很有可能通過促進不同蛋白的相互結合，從而發(fā)揮治療心肌缺血再灌注損傷的作用。

根據(jù)KEGG分析結果，結合文獻查閱，本研究認為HIF-1通路、p38MAPK通路、PI3K/AKT通路和細胞凋亡在治療心肌缺血再灌注損傷中發(fā)揮著較重要的作用。低氧誘導因子(HIF-1)能在低氧下激活多種靶基因的轉(zhuǎn)錄，HIF-1通路是機體在缺氧狀態(tài)下調(diào)節(jié)各器官生化反應的重要通路[27]。其中HIF-1α可以通過抑制TLR4/NF-κB信號通路，減少大鼠心肌缺血再灌注損傷后炎癥的發(fā)生[28]，而且可以上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子及其受體的分泌與合成，有助于缺血組織血供的恢復[29]。p38MAPK通路參與心肌缺血再灌注、心室重構等的發(fā)生[30-31]。而且研究發(fā)現(xiàn)，p38MAPK信號通路抑制劑可以改善心肌缺血再灌注損傷[32]。PI3K/AKT通路主要起到激活細胞和調(diào)控蛋白質(zhì)代謝的生物作用。AKT可以在PI3K/AKT通路中發(fā)揮中間環(huán)節(jié)的作用，調(diào)節(jié)眾多的下游通路，不僅可直接作用于Bcl-2家族，促進細胞凋亡，同時還可以激活eNOS通路，減少氧化損傷，對心肌缺血再灌注后誘發(fā)的心肌損傷有關鍵的調(diào)節(jié)作用[33]。

綜上所述，本研究從黃蛭口服液的活性成分、療效靶標和重要通路入手，初步探討黃蛭口服液的治療機理，主要包括減少缺血后有細胞毒作用產(chǎn)物的生成，減輕炎癥對細胞的損害作用以及抑制心肌細胞的凋亡，同時促進缺血組織的血供恢復。但其結果還顯示，黃蛭口服液可能通過乙肝病毒感染通路、結腸癌的發(fā)展來治療心肌缺血再灌注損傷，與現(xiàn)代研究大流方向不盡相同，但也說明黃蛭口服液治療疾病在體內(nèi)起到多方面的調(diào)節(jié)作用。鑒于網(wǎng)絡藥理學的局限性，本研究存在一點片面性，仍需后續(xù)的具體研究進一步驗證。