許春麗，馬杜康，陳 歌，趙鵬躍，黃啟良

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，北京 100193）

農(nóng)藥是重要的農(nóng)業(yè)投入品，農(nóng)藥產(chǎn)品質(zhì)量是保障農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全的重要基礎(chǔ)。然而，近年來一些農(nóng)藥生產(chǎn)企業(yè)為了追求經(jīng)濟(jì)效益，降低生產(chǎn)成本，提高農(nóng)藥產(chǎn)品防治效果和逃避農(nóng)藥登記政策等，在農(nóng)藥產(chǎn)品中添加非法成分（隱性成分或無登記農(nóng)藥）。而農(nóng)民傾向于購(gòu)買防治效果好的含非法添加成分的農(nóng)藥，這種行為更是助長(zhǎng)了農(nóng)藥生產(chǎn)企業(yè)添加非法成分的不良風(fēng)氣[1-2]。2020年我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部在全國(guó)范圍內(nèi)部署啟動(dòng)了農(nóng)資打假“春雷”行動(dòng)，重點(diǎn)查處非法添加、含量不足、侵權(quán)假冒等問題，以保障農(nóng)資產(chǎn)品質(zhì)量。

自2011年10月31日起，我國(guó)農(nóng)業(yè)部、工業(yè)信息化部、環(huán)境保護(hù)部、國(guó)家工商行政管理總局、國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局等五部委聯(lián)合發(fā)出公告，撤銷（撤回）苯線磷等10種有機(jī)磷類農(nóng)藥的登記證、生產(chǎn)許可證（生產(chǎn)批準(zhǔn)文件），停止生產(chǎn)，自2013年10月31日起，停止銷售和使用。然而，苯線磷具有較強(qiáng)的殺線蟲效果，雖然已被停止生產(chǎn)，某些企業(yè)仍可能在農(nóng)藥生產(chǎn)中非法添加苯線磷，以增強(qiáng)藥效。

苯線磷（fenamiphos），化學(xué)名O-乙基-O-(3-甲基-4-甲硫基)苯異丙基氨基磷酸酯，別名力滿庫、克線磷、苯胺磷等，是一種高毒內(nèi)吸性殺線蟲劑，兼有觸殺作用。它通過抑制靶標(biāo)生物中乙酰膽堿酯酶的活性而產(chǎn)生殺蟲效果。原藥雄性大鼠急性經(jīng)口LD50值為15.3 mg/kg，急性經(jīng)皮LD50值為500 mg/kg，急性吸入LC50值為110～175 mg/L。在試驗(yàn)劑量下，對(duì)兔皮膚和眼睛無刺激作用，對(duì)魚類毒性中等。推薦劑量下，對(duì)蜜蜂和蠶無害，對(duì)家禽劇毒。目前，在水體和土壤等多種環(huán)境介質(zhì)中均能檢測(cè)到殘留的苯線磷及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物[3]。

有文獻(xiàn)報(bào)道利用高效液相色譜法對(duì)苯線磷進(jìn)行分析，可采用外標(biāo)法定量[4-5]，然而，對(duì)于農(nóng)藥制劑產(chǎn)品中苯線磷非法添加的檢測(cè)方法尚無報(bào)道。筆者在3種代表性制殺蟲劑劑產(chǎn)品（苯氧威懸浮劑、聯(lián)苯菊酯乳油、氟蟲腈水分散粒劑）中添加不高于1%的苯線磷原藥，獲得添加苯線磷的農(nóng)藥制劑試驗(yàn)樣品，并建立了在同一液相條件下測(cè)定苯線磷在懸浮劑、乳油、水分散粒劑中的分析方法，為農(nóng)藥制劑產(chǎn)品中苯線磷非法添加的檢測(cè)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260-DAD高效液相色譜儀，美國(guó)安捷倫科技有限公司；Agilent Eclipse XDB-C18不銹鋼色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、KQ3200B超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；AL-204分析天平，梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司；有機(jī)過濾器（微膜孔徑0.45 μm）。乙腈（色譜純）、二次蒸餾水、苯線磷原藥（質(zhì)量分?jǐn)?shù)97.1%），農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)藥檢定所；250 g/L苯氧威懸浮劑，江蘇常隆農(nóng)化有限公司；100 g/L聯(lián)苯菊酯乳油、800 g/kg氟蟲腈水分散粒劑，中農(nóng)立華生物科技股份有限公司。

1.2 液相色譜操作條件

流動(dòng)相：流動(dòng)相梯度比例見表1，經(jīng)濾膜過濾，并進(jìn)行脫氣。

柱溫：30℃；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm；進(jìn)樣體積：5 μL；保留時(shí)間：苯線磷約9.9 min。典型的苯線磷標(biāo)準(zhǔn)品、苯線磷·苯氧威懸浮劑、苯線磷·聯(lián)苯菊酯乳油、苯線磷·氟蟲腈水分散粒劑樣品高效液相色譜圖見圖1。

表1 流動(dòng)相梯度比例

圖1 苯線磷及其3種混劑的高效液相色譜圖

1.3 測(cè)定步驟

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)樣品的配制

稱取0.25 g（精確至0.000 01 g）苯線磷標(biāo)樣于250 mL容量瓶中，加入50 mL乙腈，超聲波振蕩5min，冷卻至室溫，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，記為標(biāo)樣溶液。

1.3.2 試樣溶液的配制

分別稱取24.75 g苯氧威懸浮劑、聯(lián)苯菊酯乳油、氟蟲腈水分散粒劑于250 mL容量瓶中，添加0.25 g（精確至0.000 01 g）苯線磷原藥，隨后加入50 mL乙腈，超聲波振蕩5 min，冷卻至室溫，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，過濾待測(cè)。

1.3.3 測(cè)定

待儀器穩(wěn)定后，在上述操作條件下，連續(xù)注入數(shù)針標(biāo)樣溶液，直至相鄰兩針苯線磷峰面積相對(duì)變化小于1.2%后，按照標(biāo)樣溶液、試樣溶液、試樣溶液、標(biāo)樣溶液的順序進(jìn)行測(cè)定。

1.3.4 計(jì)算

將測(cè)得的兩針試樣溶液以及試樣前后兩針標(biāo)樣溶液中苯線磷峰面積分別進(jìn)行平均。試樣中苯線磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)按式（1）計(jì)算。

式中：w為試樣中苯線磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；A2為試樣溶液中苯線磷峰面積的平均值，mAU·s；m1為苯線磷標(biāo)樣的質(zhì)量，g；P為標(biāo)樣中苯線磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；A1為標(biāo)樣溶液中苯線磷峰面積的平均值，mAU·s；m2為試樣的質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動(dòng)相的選擇

由于懸浮劑、乳油、水分散粒劑干擾較大，為使有效成分得到良好的分離效果，并且分析時(shí)間相對(duì)合適，峰形尖銳，保留時(shí)間適中，根據(jù)苯線磷的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，對(duì)不同配比的乙腈和水、甲醇和水2種流動(dòng)相進(jìn)行篩選。結(jié)果表明，流動(dòng)相為乙腈＋水（體積比45∶55），流速為1.0 mL/min，苯線磷保留時(shí)間為9.9 min，能夠獲得良好的分離效果。在苯線磷出峰后仍有很多雜質(zhì)，為進(jìn)一步洗脫農(nóng)藥制劑中的其他物質(zhì)，在12～17 min將流動(dòng)相調(diào)整為乙腈＋水（體積比85∶15）可加快洗脫速度，縮減分析時(shí)間。

2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

利用紫外-可見檢測(cè)器對(duì)苯線磷溶液在210～400nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。苯線磷的紫外光譜圖見圖2。從圖2中見，苯線磷的最大吸收波長(zhǎng)約250 nm，在該波長(zhǎng)處靈敏度較高，各種雜質(zhì)不影響苯線磷的測(cè)定，能夠滿足分析的要求，故將檢測(cè)波長(zhǎng)確定為250 nm。

圖2 苯線磷紫外吸收譜圖

2.3 分析方法的特異性

本試驗(yàn)采用HPLC-DAD峰純度分析法來鑒別苯線磷。苯線磷標(biāo)樣、苯線磷·苯氧威懸浮劑、苯線磷·聯(lián)苯菊酯乳油、苯線磷·氟蟲腈水分散粒劑中的苯線磷HPLC-DAD峰純度均大于990，有效成分處無其他物質(zhì)干擾，符合定量分析要求。

2.4 分析方法的線性關(guān)系

按1.3.1標(biāo)準(zhǔn)樣品的配制方法配制標(biāo)樣溶液，用乙腈以1∶1的比例梯度稀釋4次，獲得5個(gè)濃度的有效成分線性相關(guān)溶液。在上述操作條件下，待儀器穩(wěn)定后，按照分別進(jìn)同樣體積的標(biāo)樣，進(jìn)行測(cè)定，取兩次測(cè)定的平均結(jié)果。以苯線磷質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3）。從圖3可見，當(dāng)苯線磷質(zhì)量濃度為49.34～789.41 mg/L（進(jìn)樣體積5 μL），其與相應(yīng)的苯線磷峰面積之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，計(jì)算得回歸方程為y=9.803 3x＋35.775，相關(guān)系R2=1.000 0，完全可以滿足定量分析要求。

圖3 苯線磷標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5 分析方法的精密度

從同一樣品中稱取5個(gè)試樣，在上述色譜條件下進(jìn)行分析，測(cè)得苯線磷·苯氧威懸浮劑、苯線磷·聯(lián)苯菊酯乳油、苯線磷·氟蟲腈水分散粒劑的標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.01%、0.004%和0.01%（表2）。

苯線磷·苯氧威懸浮劑中苯線磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定結(jié)果平均值為0.93%；變異系數(shù)為1.03，小于修改的Horwitz公式的計(jì)算值（2（1-0.51ogC）×0.67=2.71，其中C為樣品中有效成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的平均值）。根據(jù)農(nóng)業(yè)部行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 2887—2016《農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量分析方法》規(guī)范要求[6]，有效成分分析方法精密度的測(cè)定結(jié)果符合要求。

表2 分析方法的精密度試驗(yàn)結(jié)果

苯線磷·聯(lián)苯菊酯乳油中苯線磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定結(jié)果平均值為0.95%；變異系數(shù)為0.39，小于修改的Horwitz公式的計(jì)算值（2（1-0.51ogC）×0.67=2.70），表明有效成分分析方法精密度的測(cè)定結(jié)果符合要求。

苯線磷·氟蟲腈水分散粒劑中苯線磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定結(jié)果平均值為0.96%；變異系數(shù)為0.86，小于修改的Horwitz公式的計(jì)算值（2（1-0.51ogC）×0.67=2.69），表明有效成分分析方法精密度的測(cè)定結(jié)果符合要求。

2.6 分析方法的準(zhǔn)確度

取按1.3.2試樣溶液的制備方法配制的溶液5 mL于50 mL容量瓶中，加入6 mL按1.3.1配置的苯線磷標(biāo)樣溶液，用乙腈超聲溶解，冷卻至室溫，再用乙腈定容至刻度，搖勻。苯線磷的回收率按式（2）計(jì)算。

式中：R為回收率，%；a為測(cè)定量，mg；b為所稱樣品中待測(cè)組分量，mg；c為理論加入量，mg。

經(jīng)測(cè)定，苯線磷·苯氧威懸浮劑、苯線磷·聯(lián)苯菊酯乳油和苯線磷·氟蟲腈水分散粒劑的回收率分別為97.61%、99.92%和97.52%，試驗(yàn)結(jié)果見表3，表明有效成分分析方法準(zhǔn)確度的測(cè)定結(jié)果符合要求。

表3 分析方法的準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié) 語

利用高效液相色譜對(duì)懸浮劑、乳油、水分散粒劑中的苯線磷進(jìn)行了定性定量分析。結(jié)果表明，所采用的方法準(zhǔn)確度和精密度較高，線性關(guān)系較好，具有簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確及分離效果好等優(yōu)點(diǎn)，能夠作為農(nóng)藥制劑產(chǎn)品中苯線磷非法添加的分析測(cè)定方法。