馬好運(yùn) ，李 慧 ，王留洋 ，翁愛(ài)珍 ，趙紅盈 ，梅向東 *，折冬梅 ，寧 君

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物病蟲害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2.黑龍江省森林保護(hù)研究所，哈爾濱 150040）

銀紋夜蛾［Argyrogramma agnata(Staudinger)］隸屬鱗翅目，夜蛾科，是豆類和十字花科蔬菜重要的害蟲之一[1-2]，廣泛分布于韓國(guó)、日本、中國(guó)等亞太國(guó)家[3-4]，在中國(guó)主要分布于黃河、淮河、長(zhǎng)江流域等大豆、花生、蔬菜生產(chǎn)區(qū)，具有雜食性和遷飛性，一年發(fā)生2～7代，世代交替嚴(yán)重[5]。傳統(tǒng)多采用化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行防治，同時(shí)也利用天敵昆蟲、蘇云金桿菌SD-5、銀紋夜蛾核多角體病毒等措施進(jìn)行防治[6-7]。近年來(lái)研究表明昆蟲信息素在害蟲監(jiān)測(cè)與防控中同樣發(fā)揮著重要作用[8]，可以為銀紋夜蛾的科學(xué)防控開(kāi)辟一條新的途徑。

嗅覺(jué)是許多動(dòng)物感知外界的一種重要方式，通過(guò)調(diào)節(jié)昆蟲嗅覺(jué)來(lái)改變昆蟲的行為，可以作為一種工具有效地用于害蟲管理[9]。昆蟲信息素作為昆蟲嗅覺(jué)的重要組成部分，已廣泛地應(yīng)用于害蟲的預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)、干擾交配、大量誘捕等方面。遺憾的是，目前利用信息素對(duì)銀紋夜蛾進(jìn)行監(jiān)測(cè)與防控的研究相對(duì)較少。自1990年日本科學(xué)家Sugie等[10]提出豆銀紋夜蛾性信息素組分為順-7-十二碳烯乙酸酯（Z7-12∶Ac）和順-9-十二碳烯乙酸酯（Z9-12∶Ac）以來(lái)，幾乎沒(méi)有銀紋夜蛾信息素的相關(guān)報(bào)道。我國(guó)對(duì)銀紋夜蛾的研究也主要集中在化學(xué)防治與核多角體病毒及蛋白受體等方面。中國(guó)是日本的鄰國(guó)，但地理隔離常常導(dǎo)致昆蟲性信息素存在多樣性，即不同地域的同一種昆蟲性信息素在組分和比例方面可能存在一定的差異[11]。因此，明確銀紋夜蛾中國(guó)品系性信息素的組分，開(kāi)展相應(yīng)的性信息素及其類似物的研究，對(duì)于中國(guó)銀紋夜蛾的綠色防控具有重要意義。

先前的研究顯示天然的信息素存在田間易降解、合成成本高等問(wèn)題，昆蟲性信息素類似物作為昆蟲性信息素的衍生與發(fā)展，不僅可以有效地彌補(bǔ)天然性信息素的不足，同時(shí)還能夠有效地調(diào)節(jié)昆蟲的化學(xué)通訊，繼而影響昆蟲的行為[12]。自1967年第一個(gè)關(guān)于舞毒蛾的性信息素拮抗劑報(bào)道以來(lái)[13]，有關(guān)昆蟲性信息類似物的研究逐漸增多，近年來(lái)已成為研究熱點(diǎn)[14-16]。昆蟲性信息素類似物主要來(lái)源于對(duì)天然性信息素的修飾，其修飾主要包括碳鏈修飾和極性基團(tuán)修飾。極性基團(tuán)修飾包括甲酸酯、丙酸酯等普通酯基取代和氟代乙酸酯、氯代乙酸酯等鹵化酯基取代2種情形：①在普通酯基取代的研究中，Camps等[17]發(fā)現(xiàn)松舟異蛾信息素的甲酸酯和丙酸酯類似物與天然信息素以一定比例混合后，對(duì)天然信息素有較好的增效活性；然而Schwarz等[18]發(fā)現(xiàn)歐洲玉米螟信息素甲酸酯取代類似物對(duì)其天然信息素有較強(qiáng)的拮抗活性；Roelofs等[19]發(fā)現(xiàn)紅縱卷葉蛾信息素的甲酸酯和丙酸酯取代類似物對(duì)其天然信息素也具有一定的抑制活性。②在鹵化酯基取代的研究中，徐妍等[20]發(fā)現(xiàn)梨小食心蟲性信息素組分Z8-12∶Ac的氯甲酸酯類似物能夠顯著降低成蟲近距離的交配率；Siderhurst等[21]發(fā)現(xiàn)果蠅Drosophilid的信息素組分覆盆子酮的三氟取代類似物，其表現(xiàn)出與天然性信息素相當(dāng)?shù)囊T活性；張開(kāi)心[16]在小菜蛾性信息素鹵代類似物的設(shè)計(jì)合成中發(fā)現(xiàn)有3種鹵代類似物能夠顯著干擾小菜蛾的化學(xué)通訊。在此基礎(chǔ)上筆者對(duì)銀紋夜蛾性信息素組分順-9-十二碳烯乙酸酯（Z9-12∶Ac）的極性基團(tuán)進(jìn)行了不同的修飾，其中包括對(duì)其極性端進(jìn)行普通酯基取代以及鹵化酯基取代修飾，設(shè)計(jì)合成出了4種結(jié)構(gòu)新穎的銀紋夜蛾性信息素類似物，并對(duì)所合成的化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。室內(nèi)昆蟲電生理（EAG）顯示，銀紋夜蛾雄蟲對(duì)4種化合物均表現(xiàn)出較好的響應(yīng)，這一結(jié)果使銀紋夜蛾利用昆蟲信息素類似物進(jìn)行監(jiān)測(cè)與防控成為可能，為銀紋夜蛾的綠色防控開(kāi)辟了新途徑。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器：Bruker-500MHz NMR核磁共振儀、Bruker solariX質(zhì)譜儀，布魯克（北京）科技有限限公司；觸角電位儀，荷蘭欣泰公司。

試劑：順-9-十二碳烯-1-醇（純度95%），上海麗晶生化科技有限公司；丙酰氯、異丁酰氯、2-氯乙酰氯、3-氯丙酰氯（AR級(jí)），上海源葉生物科技有限公司；二氯甲烷（DCM）、三乙胺（TEA）（AR級(jí)），上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

供試蟲源：銀紋夜蛾成蟲采集于北京市延慶區(qū)舊縣鎮(zhèn)有機(jī)農(nóng)業(yè)示范園。實(shí)驗(yàn)試蟲為實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)羽化后成蟲；飼養(yǎng)條件為：溫度25±3℃，相對(duì)濕度70±10%，光周期16 h∶8 h（L∶D）。將羽化的成蟲單獨(dú)置于拇指管中，并用10%的蜂蜜水飼養(yǎng)，以備使用。

1.2 合成

4種銀紋夜蛾性信息素類似物的合成路線見(jiàn)圖1。

圖1 4種銀紋夜蛾性信息素類似物的合成路線

1.3 合成步驟

以順-9-十二碳烯-1-醇丙酸酯（W1）的合成為例：向裝有磁子的圓底燒瓶中依次加入1.0 g順-9-十二碳烯-1-醇、25 mL重蒸DCM、0.82 g三乙胺，冰鹽浴下攪拌5 min。將0.75 g丙酰氯溶于5 mL重蒸DCM中，用膠頭滴管將丙酰氯溶液逐滴加入上述溶液中。低溫反應(yīng)30 min后撤去冰鹽浴，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)，待反應(yīng)結(jié)束后，用去離子水淬滅反應(yīng)。用有機(jī)層經(jīng)飽和食鹽水洗滌、無(wú)水硫酸鈉干燥后，減壓下濃縮，得到淡黃色狀粗產(chǎn)物。粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱分離（乙酸乙酯∶石油醚=1∶30），得到目標(biāo)產(chǎn)物順-9-十二碳烯-1-醇丙酸酯（W1），產(chǎn)率為78%。

采用與目標(biāo)化合物W1相類似的合成方法合成類似物W2～W4。

W1～W4的物理性狀、產(chǎn)率、核磁共振數(shù)據(jù)及質(zhì)譜數(shù)據(jù)如下：

順-9-十二碳烯-1-醇丙酸酯（W1）為淺黃色油狀物，產(chǎn)率78%。

1H NMR（500 MHz，CDCl3）δ：5.81-5.72（m，2H）、4.51（t，J=13.6 Hz，2H）、2.77-2.73（m，2H）、2.49-2.43（m，4H）、2.06-1.56（m，12H）、1.40（t，J=15.1 Hz，3H）、0.52（t，J=22.0 Hz，3H）；13C-NMR （500 MHz，CDCl3）δ：173.61、130.57、128.34、63.46、28.71、28.37、28.21、28.15、27.83、26.62、26.05、24.89、19.49、13.37、8.16；HR-MS（ESI）：m/zCalcd for C15H29O2［M＋H］＋，240.2101；found 240.2105。

順-9-十二碳烯-1-醇異丁酸脂（W2）為淺黃色油狀物，產(chǎn)率43%。

1H NMR（500 MHz，CDCl3）δ：5.64-5.61（m，2H）、4.38（t，J=15.7 Hz，2H）、2.78-2.72（m，2H）、2.34-2.31（m，H）、2.30-2.28（m，2H）、1.88-1.62（m，12H）、1.41（t，J=18.4 Hz，6H）、0.52（t，J=19.8Hz，3H）；13C-NMR（500 MHz，CDCl3）δ：170.12、128.31、128.25、61.23、31.25、29.82、29.80 （2C）、29.42、28.96、27.82、25.34、20.35、18.72（2C）、7.86；HR-MS（ESI）：m/zCalcd for C16H31O2［M＋H］＋，254.4108；found 254.4114。

順-9-十二碳烯-2-氯乙酸酯（W3）為淡黃色油狀物，產(chǎn)率65%。

1H NMR（500 MHz，CDCl3）δ：5.32-5.28（m，2H）、4.40（s，2H）、4.21（t，J=17.8 Hz，2H）、2.22-2.08（m，4H）、1.68-1.24（m，12H）、0.58（t，J=15.4Hz，3H）；13C-NMR（500MHz，CDCl3）δ：163.12、131.15、130.55、63.21、39.84、28.42、28.13（2C）、28.06、27.98、27.35、25.65、19.38、10.25；HR-MS（ESI）：m/zCalcd for C14H26ClO2［M＋H］＋，260.8012；found 260.0816。

順-9-十二碳烯-3-氯丙酸酯（W4）為淡黃色油狀物，產(chǎn)率58%。1H NMR（500 MHz，CDCl3）δ：5.45-5.41（m，2H）、4.20（t，J=13.6 Hz，2H）、3.96（t，J=14.3 Hz，2H）、2.49（t，J=16.4 Hz，2H）、2.18-19.78（m，4H）、1.58-1.25（m，12H）、0.64（t，J=21.3 Hz，3H）；13C-NMR（500 MHz，CDCl3）δ：170.32、132.31、132.25、62.81、38.72、38.02、29.32、29.31（2C）、29.25、28.75、27.67、27.53、20.02、12.13；HR-MS（ESI）：m/zCalcd for C15H28ClO2［M＋H］＋，274.8302；found 274.8308。

1.4 室內(nèi)生物活性測(cè)試

昆蟲觸角電生理實(shí)驗(yàn)（EAG）的具體操作如下：

分別準(zhǔn)確稱量0.10 g所合成的4種銀紋夜蛾性信息素類似物，將其各自溶于1 mL的色譜純正己烷溶液中，采用梯度稀釋配置為0.01、0.1、1、10、100、1 000 μg/μL的待測(cè)溶液。將不同質(zhì)量濃度的待測(cè)溶液均勻地滴加在對(duì)折的濾紙條上（長(zhǎng)6 cm，寬1 cm），將上述濾紙條放入巴斯德管內(nèi)（長(zhǎng)22.5 cm，內(nèi)徑6 mm），以添加有分析純正己烷的濾紙條作為對(duì)照，實(shí)驗(yàn)藥劑現(xiàn)配現(xiàn)用，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

挑選健康羽化2～3 d的銀紋夜蛾雄性成蟲用于實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)前黑暗處理2 h，實(shí)驗(yàn)時(shí)用鑷子在顯微鏡下完整取下雄蟲的觸角，為保證電路的暢通，用刀片切除觸角的基部與末梢。將切好的觸角搭在玻璃電極的兩端，組成閉合回路，玻璃電極用0.1 mol/L氯化鉀溶液填充。為保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，每頭雄蟲用一根觸角，每個(gè)處理重復(fù)3次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用SPSS-24數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行分析，差異性顯著分析利用單因素方差分析（One-Way ANOVA）（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 合成及表征

在銀紋夜蛾性信息素類似物W1～W4的合成中，為保證原料能夠反應(yīng)完全，醇與酰氯最佳加料比例為1.0∶1.2～1.5[22]。為避免酰氯與水接觸而溶解，反應(yīng)溶劑二氯甲烷需經(jīng)干燥處理[23]。在醇與酰氯接觸的瞬間會(huì)因反應(yīng)體系溫度升高導(dǎo)致副產(chǎn)物增多，可將反應(yīng)體系置于冰鹽浴中，以保持反應(yīng)體系始終處于低溫狀態(tài)[24]。由于異丁基相比于丙基、3-氯-丙基相比2-氯-乙基的空間位阻較大，因此類似物W2、W4的產(chǎn)率分別低于W1和W3。同時(shí)在分離純化類似物W2時(shí)，由于副產(chǎn)物較多，需經(jīng)多次純化，因此W2的產(chǎn)率較低。

采用核磁共振儀對(duì)合成得到的銀紋夜蛾類似物W1～W4進(jìn)行分析，所得化合物與預(yù)期產(chǎn)物結(jié)構(gòu)一致。以W1為例，在1H NMR中，目標(biāo)化合物由于羰基的存在，與羰基相連的兩個(gè)碳上的氫的δ值向低場(chǎng)移動(dòng)，其中與氧原子相連的碳原子上的氫化學(xué)位移值為4.51～4.48，表現(xiàn)為t峰，與羰基直接相連碳上的氫δ值為2.77～2.73，表現(xiàn)為m峰。由于共軛雙鍵的存在，順式雙鍵上的兩個(gè)氫的化學(xué)位移值向低場(chǎng)移動(dòng)，δ值為5.81～5.72，表現(xiàn)為多峰。末端兩個(gè)甲基峰受相鄰碳上氫原子的影響，表現(xiàn)為三重峰，δ值分別為1.40～1.37、0.52～0.48。其余碳上的氫的化學(xué)位移主要集中于2.06～1.56，呈現(xiàn)出多重峰。

2.2 EAG活性

4種銀紋夜蛾信息素的類似物昆蟲觸角電生理試驗(yàn)，結(jié)果如表1。銀紋夜蛾雄蟲對(duì)合成的4種結(jié)構(gòu)新穎的類似物均有響應(yīng)，并呈現(xiàn)出劑量-效應(yīng)關(guān)系。類似物W1與W4在較低濃度時(shí)響應(yīng)值出現(xiàn)負(fù)值，即響應(yīng)值小于對(duì)照正己烷的，這可能是由于昆蟲觸角初次接受外界刺激時(shí)，反應(yīng)靈敏度較高，隨著刺激次數(shù)的不斷增加，昆蟲觸角性信息素結(jié)合蛋白的電位變化反應(yīng)處于疲憊狀態(tài)，只有接受足夠高濃度的刺激時(shí)，才能打破這種因疲憊而產(chǎn)生的誤差。當(dāng)刺激質(zhì)量濃度增加到10 μg/μL時(shí)，銀紋夜蛾對(duì)不同類似物的響應(yīng)值隨刺激濃度升高而增加，直到達(dá)到飽和狀態(tài)[25]（圖2）。當(dāng)質(zhì)量濃度增加到1 000 μg/μL時(shí)，4種類似物的響應(yīng)值也到達(dá)了最大值，其中類似物W2的響應(yīng)值最大，達(dá)到了1.40±0.33 mV。銀紋夜蛾雄蟲對(duì)4種類似物質(zhì)量濃度為10～100 μg/μL時(shí)，反應(yīng)最為靈敏，因此，推測(cè)這4種類似物在田間最佳使用質(zhì)量濃度應(yīng)定位于10～100 μg/μL。此電生理實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)其他行為實(shí)驗(yàn)，以及田間試驗(yàn)在最佳使用劑量、配比等方面的篩選具有一定的指導(dǎo)作用。

表1 銀紋夜蛾性信息素類似物直接刺激EAG活性

3 結(jié)論與討論

本文對(duì)銀紋夜蛾性信息素組分進(jìn)行不同類型的修飾，設(shè)計(jì)合成了4種結(jié)構(gòu)新穎的銀紋夜蛾性信息素類似物W1～W4。受空間位阻和鹵原子電負(fù)性的影響，類似物W2、W4的產(chǎn)率分別低于與其結(jié)構(gòu)相似的W1和W3。合成反應(yīng)時(shí)加入過(guò)量的酰氯和適當(dāng)?shù)目`酸劑，能夠保證反應(yīng)充分進(jìn)行。為避免因反應(yīng)接觸瞬間反應(yīng)體系溫度升高而導(dǎo)致副產(chǎn)物增多，將反應(yīng)體系置于冰鹽浴中。室內(nèi)電生理實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，銀紋夜蛾對(duì)4種類似物均有一定的響應(yīng)值，并呈現(xiàn)出劑量-效應(yīng)關(guān)系。但電生理實(shí)驗(yàn)只是研究昆蟲對(duì)嗅覺(jué)化學(xué)感受行為的一部分，并不能完全模擬昆蟲在自然條件下對(duì)不同氣味的反應(yīng)強(qiáng)度，本文所合成的銀紋夜蛾性信息素類似物是否具有較好的田間生物活性，需展開(kāi)進(jìn)一步的研究與驗(yàn)證。同時(shí)，昆蟲性信息素類似物的合成有效地彌補(bǔ)了天然信息素在田間易降解、持效期短等缺點(diǎn)，為銀紋夜蛾的綠色防控提供了新思路。