石 妍 ，肖 順 ，周 挺 ，梁頒捷 ，張珊珊 ，張紹升 ，劉國(guó)坤 ，顧 鋼 *

（1.福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，福州 350002；2.福建省煙草公司煙草科學(xué)研究所，福州 350003；3.福建省煙草公司三明市公司，福建三明 365000）

二氯喹啉酸是一種激素型喹啉羧酸類除草劑[1]，主要用于稗草的防治。由于其具有適用期長(zhǎng)、用量少、使用間隔期寬等優(yōu)點(diǎn)[1-2]，在我國(guó)水稻種植區(qū)廣泛使用。二氯喹啉酸在土壤中降解緩慢[3]，由于不科學(xué)的使用，造成其在土壤中積累，易對(duì)后茬輪作敏感作物，如茄科、豆科、傘形花科等作物，產(chǎn)生藥害。在水稻與煙草輪作區(qū)，土壤中殘留的二氯喹啉酸可造成煙葉生長(zhǎng)畸形[3-5]，表現(xiàn)為煙葉扭曲、黃化，葉片較小等，給煙農(nóng)帶來(lái)經(jīng)濟(jì)損失。因此，檢測(cè)土壤中二氯喹啉酸的殘留具有重要意義。

關(guān)于二氯喹啉酸殘留檢測(cè)最常用的方法是高效液相色譜法[1-2，4-11]，而氣相色譜法[12-13]和毛細(xì)管電泳法[14]使用較少。高效液相色譜法前處理較簡(jiǎn)單，但對(duì)于不同地區(qū)土壤樣品中二氯喹啉酸的提取，其前處理方法不盡相同。如陳虹等[1]以甲醇＋0.05 mol/L硼砂溶液（體積比9∶1）為提取溶劑，離心后取上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，甲醇定容，HPLC法測(cè)定。鄭雄志等[2]以0.05 mol/L氫氧化鈉溶液為提取溶劑，提取液離心后調(diào)成酸性，用乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，甲醇定容，HPLC法測(cè)定。李麗春等[5]以甲醇＋0.05 mol/L硼砂溶液為提取溶劑，提取液調(diào)成酸性后用二氯甲烷萃取，經(jīng)濃縮后甲醇定容，HPLC法測(cè)定。本研究以福建煙區(qū)土壤為樣本，通過(guò)對(duì)儀器相關(guān)條件和樣品的前處理方法進(jìn)行優(yōu)化，建立高效液相色譜檢測(cè)煙田土壤中二氯喹啉酸殘留量的方法。

1 材料與方法

1.1 試劑和材料

二氯喹啉酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度為98%），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；色譜級(jí)甲醇，德國(guó)Merck公司；硼砂、乙酸、氫氧化鈉、乙酸乙酯、磷酸、無(wú)水硫酸鈉均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

土壤樣品：由福建省三明市清流縣煙草試驗(yàn)站提供，采集方法參照NY/T 39—2012《農(nóng)田土壤環(huán)境質(zhì)量監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范》[15]中的方法。

1.2 儀器設(shè)備

Waters e2695高效液相色譜儀，美國(guó)Waters公司；N-1100D-W旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海愛(ài)朗儀器有限公司；Avanti J-E離心機(jī)，美國(guó)Beckman Coulter有限公司；Milli-Q超純水機(jī)，美國(guó)Millipore科學(xué)儀器公司；KQ-2200DE超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；Practum224-1CN電子天平，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 土壤樣品預(yù)處理

土壤樣品經(jīng)風(fēng)干、去除雜物后研磨過(guò)20目篩（孔徑0.83 mm），于-20℃冰箱冷藏備用[15]。

1.3.2 土壤樣品提取

選取2種以堿性溶液提取土壤中二氯喹啉酸的方法，比較這2種方法的回收率及對(duì)二氯喹啉酸的分離效果。

（1）參考陳虹等[1]的方法，稍作改動(dòng)。稱取10.0 g土樣于150 mL具塞三角瓶中，加入30 mL甲醇＋0.05mol/L硼砂溶液（體積比9∶1）作為提取液，渦旋混勻1 min，超聲振蕩提取2 h[1]。然后將提取液轉(zhuǎn)入離心管中，以5 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min。取上清液，用無(wú)水硫酸鈉去除上清液中殘余水分，取15 mL濾液于50 mL圓底燒瓶中，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至接近干燥狀態(tài)，再用1.5 mL甲醇溶解，過(guò)0.22 μm濾膜后即得待測(cè)液。

（2）參考鄭雄志等[2]的方法，稍作改動(dòng)。稱取土樣10.0 g，置于150 mL具塞三角形瓶中，加入提取液0.05 mol/L氫氧化鈉溶液30 mL，渦旋混勻1 min，超聲振蕩提取2 h。然后將提取液轉(zhuǎn)入離心管中，以5 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min。取上清液15 mL，用磷酸調(diào)節(jié)pH為2.5左右，然后用乙酸乙酯萃取2次，每次用量為15 mL，合并乙酸乙酯相[2]。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至接近干燥狀態(tài)，用1.5 mL甲醇溶解，過(guò)0.22 μm濾膜后即得待測(cè)液。

1.3.3 液相分析

1.3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取適量二氯喹啉酸標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇（色譜級(jí)）配成質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。將儲(chǔ)備液放入4℃冰箱保存，使用時(shí)再稀釋配成所需的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3.3.2 液相色譜檢測(cè)條件

流動(dòng)相為甲醇＋1%乙酸水溶液（體積比65∶35）；流速為1.0 mL/min；柱溫為40℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為238 nm；進(jìn)樣體積為20 μL；色譜柱為Diamonsil-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；檢測(cè)器為二極管陣列檢測(cè)器（PDA）。在此條件下，二氯喹啉酸的保留時(shí)間為5.027 min左右。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 流動(dòng)相的選擇

取質(zhì)量濃度為10 mg/L的二氯喹啉酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行上機(jī)分析，比較不同體積比（65∶35，60∶40，55∶55）的甲醇＋1%乙酸水溶液作為流動(dòng)相的分離效果。結(jié)果表明，在該試驗(yàn)條件下，體積比為65∶35的甲醇＋1%乙酸水溶液作為流動(dòng)相時(shí)出峰時(shí)間較早且溶劑吸收強(qiáng)度較?。▓D1）。標(biāo)樣及樣品經(jīng)反復(fù)測(cè)試后，筆者選擇體積比為65∶35的甲醇＋1%乙酸水溶液作為流動(dòng)相。

圖1 不同流動(dòng)相體積比下二氯喹啉酸的液相色譜圖

2.1.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

在190～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)質(zhì)量濃度為10 mg/L的二氯喹啉酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行紫外波長(zhǎng)掃描，獲得紫外吸收光譜圖。結(jié)果表明，二氯喹啉酸在226 nm處吸收最強(qiáng)，在226～238 nm處吸收較好，峰強(qiáng)度相差不大。然而，在實(shí)際檢測(cè)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，在226 nm和230 nm波長(zhǎng)處的溶劑吸收峰強(qiáng)度較大（圖2）。因此，綜合考慮，筆者選擇238 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2 提取方法選擇

二氯喹啉酸屬于弱酸性物質(zhì)（pH=4.35），在水中的溶解度很小，可溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑[1]。在堿性環(huán)境下，二氯喹啉酸轉(zhuǎn)化為鹽的形式，使其溶解性得以提高[1，11]。在查閱相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，筆者選取兩種以堿性溶液提取土壤中二氯喹啉酸的方法，比較兩種方法的回收率及對(duì)二氯喹啉酸的分離效果。對(duì)加標(biāo)濃度為1.0 mg/kg的空白土壤樣品進(jìn)行提取，每種方法重復(fù)3次。結(jié)果表明：方法1，即提取溶劑為甲醇＋0.05 mol/L硼砂溶液（體積比9∶1）的處理方法，回收率較高，且色譜峰分離較好，峰形對(duì)稱，平均回收率為93.40%；方法2，即提取溶劑為0.05 mol/L氫氧化鈉溶液的處理方法，回收率較低，分離效果較差，平均回收率為80.40%（圖3）。綜合考慮，本試驗(yàn)選取甲醇＋0.05mol/L硼砂溶液（體積比9∶1）為提取溶劑，方法1作為本試驗(yàn)的前處理方法。

圖2 二氯喹啉酸的液相色譜圖

圖3 土壤中二氯喹啉酸的液相色譜圖

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 基質(zhì)效應(yīng)、標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限

目前，基質(zhì)效應(yīng)（EM）常采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率之比進(jìn)行評(píng)價(jià)[16-17]，當(dāng)0.9≤EM≤1.1時(shí)，無(wú)明顯基質(zhì)效應(yīng)；當(dāng)EM＜0.9時(shí)，表明存在基質(zhì)抑制（減弱）效應(yīng)；當(dāng)EM＞1.1時(shí)，表明存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。

采用梯度稀釋法將二氯喹啉酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用甲醇逐級(jí)稀釋，配制成質(zhì)量濃度分別為10.0、5.0、2.5、1.0、0.5、0.25 mg/L的6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。同時(shí)用空白土壤基質(zhì)提取液（按照1.3.2方法1中的前處理方法提?。槿軇┡渲贫揉針?biāo)準(zhǔn)溶液（濃度梯度與用甲醇配制的一致）。按1.3.3.2的液相色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以進(jìn)樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明不同基質(zhì)中二氯喹啉酸質(zhì)量濃度在0.25～10.0 mg/L范圍內(nèi)與峰面積具有良好的線性關(guān)系。土壤EM值為1.05，說(shuō)明無(wú)明顯基質(zhì)效應(yīng)，可忽略。

分別以3倍信噪比（S/N=3）和10倍信噪比（S/N=10）計(jì)算方法檢出限為0.005 mg/kg，定量限為0.025 mg/kg（表1）。

表1 二氯喹啉酸的基質(zhì)效應(yīng)、標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限

2.3.2 加標(biāo)回收率及精密度

以空白土壤樣品作為基質(zhì)，添加高、中、低3個(gè)濃度水平的二氯喹啉酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，振蕩混勻后室溫培養(yǎng)24 h，按照1.3.2方法（1）中的前處理方法及優(yōu)化后的色譜條件進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，每個(gè)處理水平重復(fù)5次，連續(xù)測(cè)3 d。結(jié)果表明，在0.1、0.5、1.0 mg/kg加標(biāo)水平下，二氯喹啉酸的平均回收率為93.40%～100.94%，日內(nèi)和日間精密度分別為1.38%～8.09%，5.64%～6.16%（表2），說(shuō)明本試驗(yàn)方法的準(zhǔn)確性較高，重現(xiàn)性較好，能滿足農(nóng)殘分析的要求。

表2 二氯喹啉酸在土壤中的加標(biāo)回收率（n=5）

2.4 實(shí)際土壤樣品測(cè)定

試驗(yàn)所用的土壤樣品由福建省三明市清流縣煙草試驗(yàn)站采集，采用1.3.2方法（1）中的前處理方法及優(yōu)化后的色譜條件對(duì)供試的8個(gè)土壤樣品進(jìn)行提取、測(cè)定，結(jié)果顯示8個(gè)送檢的土壤樣品均未檢出二氯喹啉酸（或低于檢出限）。實(shí)際分析測(cè)試樣品時(shí)，可根據(jù)樣品中二氯喹啉酸殘留量的高低，適當(dāng)減少或增加稱樣量。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)建立了高效液相色譜法檢測(cè)煙田土壤中二氯喹啉酸殘留量的方法。在優(yōu)化的試驗(yàn)條件下，二氯喹啉酸在土壤中的平均回收率為93.40%～100.94%，日內(nèi)和日間精密度分別為1.38%～8.09%，5.64%～6.16%，檢出限為0.005 mg/kg，定量限為0.025mg/kg。該方法回收率較高，重現(xiàn)性較好，且前處理過(guò)程較簡(jiǎn)單，分析時(shí)間短，有機(jī)溶劑用量較少，能滿足煙田土壤中二氯喹啉酸殘留量的快速檢測(cè)要求。

本試驗(yàn)選取并對(duì)比了2種以堿性溶液提取土壤中二氯喹啉酸的方法，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行前處理方法和液相色譜條件的優(yōu)化。其中方法1以甲醇/硼砂溶液為提取劑，超聲振蕩提取。離心后將提取液去除水分，濃縮，甲醇定容，得待測(cè)液。因提取液含有少量水分會(huì)增加減壓濃縮時(shí)間，故用無(wú)水硫酸鈉去除殘余水分后再濃縮，而陳虹等[1]的方法是將離心后的提取液用濾紙過(guò)濾后直接濃縮，用濾紙過(guò)濾可能會(huì)造成目標(biāo)物的損失。方法2以氫氧化鈉溶液振蕩提取后再用乙酸乙酯萃取。該方法所需溶劑用量較多，液-液萃取過(guò)程中發(fā)現(xiàn)易形成乳液[18]，造成目標(biāo)物的損失。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明方法1回收率較高且色譜峰分離較好、峰形對(duì)稱。因此，本試驗(yàn)選用方法1作為前處理方法。對(duì)比陳虹等[1]和鄭雄志等[2]的方法，本研究所采用的前處理方法優(yōu)勢(shì)在于減少了時(shí)間的消耗、溶劑的損耗和目標(biāo)物的損失。通過(guò)對(duì)色譜條件的優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)對(duì)土壤中二氯喹啉酸的快速分離、檢測(cè)。此外，選取的兩種方法均是用振蕩器振蕩提取，本試驗(yàn)選用超聲清洗器振蕩提取，結(jié)果同樣可行。雖然已有其他研究[3-14]報(bào)道了采用不同的提取方法或不同的色譜條件進(jìn)行二氯喹啉酸的檢測(cè)分析，但實(shí)際分析檢測(cè)時(shí)還需根據(jù)不同地區(qū)的樣品和實(shí)驗(yàn)條件建立最適合的方法。