王菁華， 彭志紅， 周 倩， 田 音

陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院(重慶西南醫(yī)院)消化內(nèi)科，重慶 400038

早期胃癌是指局限于黏膜或黏膜下層的胃癌，隨著近年來內(nèi)鏡診療技術(shù)的發(fā)展，早期胃癌的診斷率有所提高，內(nèi)鏡下手術(shù)也被越來越多地用于早期胃癌的治療。內(nèi)鏡黏膜下剝離術(shù)(endoscopic submucosal dissection，ESD)是在內(nèi)鏡下黏膜切除術(shù)(endoscopic mucosal resection，EMR)基礎(chǔ)上發(fā)展而來的內(nèi)鏡下手術(shù)方式，能夠?qū)⒉∽凁つぜ梆つは聦油暾麆冸x并取得更為理想的整體切除率及組織學(xué)完整切除率，因而也被日本的研究作為內(nèi)鏡下治療早期胃癌的標(biāo)準(zhǔn)方式[1-3]。國內(nèi)近年來也開展了ESD，白順滟等[4]研究報道了3.2%的早期胃癌患者ESD術(shù)后發(fā)生復(fù)發(fā)，針對早期胃癌患者ESD術(shù)后的復(fù)發(fā)進(jìn)行早期評價、篩選可能發(fā)生復(fù)發(fā)的高危人群并進(jìn)行嚴(yán)密隨訪具有積極的臨床意義。

性別決定區(qū)Y框蛋白1(sex determining region Y-box 1，SOX1)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一類抑癌基因，屬于高遷移率族蛋白DNA結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子家族，對多種基因的表達(dá)具有調(diào)控作用[5]。胡愛萍等[6]在胃癌GES-1細(xì)胞中的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，過表達(dá)SOX1能夠通過下調(diào)β-catenin的表達(dá)抑制GES-1細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲，表明SOX1靶向β-catenin通路在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中起到抑癌作用。但SOX1在早期胃癌中表達(dá)的變化及意義均未闡明。因此，本研究將以接受ESD的早期胃癌患者作為對象，分析早期胃癌組織中SOX1與β-catenin的相關(guān)關(guān)系及其對ESD術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)測價值。

1 材料與方法

1.1 臨床資料選取2015年1月至2018年6月在我院接受ESD治療的早期胃癌患者，入組標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合早期胃癌的診斷，T1～2N0M0；(2)符合ESD指征[7]；(3)臨床樣本按要求收集并保存；(4)病歷資料及術(shù)后隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)術(shù)前接受過放化療；(2)術(shù)后接受放化療；(3)既往有其他惡性腫瘤病史。共納入402例患者，男211例，女191例，年齡(52.14±9.97)歲(35～67歲)。另選取同期在我院接受胃鏡下胃黏膜活檢并經(jīng)病理證實(shí)為正常胃黏膜的受試者作為對照組，共108名，男64名，女44名，年齡(49.91±9.77)歲(35～62歲)。早期胃癌患者和正常胃黏膜受試者一般資料相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 試劑與儀器SP二步法免疫組化試劑盒(貨號KIT-9710)購自福州邁新生物公司，RIPA裂解液(貨號P0013C)及BCA蛋白定量試劑盒(貨號P0011)購自上海碧云天公司，SOX1(貨號EPR4766)、β-catenin(貨號ab16051)的抗體購自Abcam公司，正置顯微鏡購自Nikon公司，凝膠成像系統(tǒng)購自上海勤翔公司。

1.3 方法

1.3.1 臨床樣本的收集及保存：ESD術(shù)后收集早期胃癌組織適量，胃黏膜活檢時收集正常胃黏膜組織適量，生理鹽水清洗后，早期胃癌組織與正常胃黏膜組織均分為兩份，一份用4%多聚甲醛固定后石蠟包埋、蠟塊室溫保存，另一份在液氮中冷凍、取出后-80 ℃冰箱保存。

1.3.2 免疫組化檢測：取石蠟包埋的組織樣本，制作病理切片后按照SP二步法免疫組化試劑盒的說明書進(jìn)行操作，對SOX1、β-catenin進(jìn)行染色，在顯微鏡下隨機(jī)觀察5個高倍視野(400×)并計(jì)數(shù)100個細(xì)胞，按照陽性染色細(xì)胞比例及染色強(qiáng)度進(jìn)行評分，方法如下：陽性染色細(xì)胞≤5%為0分、>5%且≤25%為1分、>25%且≤50%為2分、>50%且≤75%為3分、>75%為4分，染色強(qiáng)度不染色為0分、淺黃色為1分、棕黃色為2分、棕褐色為3分，兩項(xiàng)評分相乘≥4分為陽性。

1.3.3 Western blotting檢測：取液氮冷凍的組織樣本，加入RIPA裂解液后充分裂解組織、提取蛋白并測定蛋白含量，取含有30 μg蛋白的樣本，加入SDS-PAGE中進(jìn)行電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜后在5%脫脂牛奶中室溫封閉1 h，在1∶1 000稀釋的SOX1、β-catenin抗體或1∶5 000稀釋的β-actin抗體中4 ℃孵育過夜；次日，洗膜3遍并在1∶1 000稀釋的HRP二抗中室溫孵育1 h，最后在凝膠成像系統(tǒng)中顯影得到SOX1、β-catenin、β-actin的條帶，掃描條帶灰度值并以β-actin為內(nèi)參計(jì)算SOX1、β-catenin的蛋白表達(dá)量。

1.3.4 隨訪：ESD術(shù)后3個月內(nèi),每個月復(fù)查1次;術(shù)后3～12個月,每3個月復(fù)查1次;1年后,每6個月復(fù)查1次，復(fù)查項(xiàng)目包括血常規(guī)、生化、胃鏡等。隨訪截止日期為2019年12月31日，隨訪并記錄患者的復(fù)發(fā)情況。

2 結(jié)果

2.1 早期胃癌組織和正常胃黏膜組織中SOX1、β-catenin表達(dá)的比較與正常胃黏膜組織比較，早期胃癌組織中SOX1陽性率、SOX1蛋白表達(dá)量明顯降低,β-catenin陽性率、β-catenin蛋白表達(dá)量明顯增加(P<0.05)(見圖1～2、表1)。

2.2 早期胃癌組織中SOX1與β-catenin表達(dá)的相關(guān)性經(jīng)Spearman檢驗(yàn)，早期胃癌組織中SOX1的陽性率與β-catenin的陽性率呈負(fù)相關(guān)(r=-0.394，P=0.013)；經(jīng)Pearson檢驗(yàn)，早期胃癌組織中SOX1的蛋白表達(dá)量與β-catenin的蛋白表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)(r=-0.438，P=0.008)。

圖1 早期胃癌組織和正常胃黏膜組織中SOX1、β-catenin的免疫組化圖(放大400倍)

2.3 不同臨床病理特征早期胃癌組織中SOX1、β-catenin表達(dá)的比較不同性別、年齡患者的早期胃癌組織中SOX1陽性率、β-catenin陽性率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與中-高分化、黏膜內(nèi)早期胃癌組織比較，低-未分化、黏膜下早期胃癌組織中SOX1陽性率明顯降低(P<0.05);T1期與T2期早期胃癌組織中SOX1陽性率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與黏膜內(nèi)早期胃癌組織比較，黏膜下早期胃癌組織中β-catenin陽性率明顯增加(P<0.05)，T1期與T2期、中-高分化與低-未分化早期胃癌組織中β-catenin陽性率的比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表2)。

圖2 早期胃癌組織與正常胃黏膜組織中SOX1、β-catenin的蛋白條帶圖

表1 早期胃癌組織與正常胃黏膜組織中SOX1、β-catenin表達(dá)的比較

表2 不同臨床病理特征早期胃癌組織中SOX1、β-catenin陽性率的比較[例數(shù)(%)]Tab 2 Comparison of SOX1 and β-catenin positive rates in early gastric cancer tissues with different clinicopathological features [n(%)]

2.4 SOX1、β-catenin陽性及陰性表達(dá)患者腫瘤復(fù)發(fā)的Kaplan-Meier曲線分析繪制早期胃癌患者ESD術(shù)后復(fù)發(fā)的Kaplan-Meier曲線并分析，與SOX1陰性表達(dá)患者比較，SOX1陽性表達(dá)患者的復(fù)發(fā)率明顯降低(P<0.05)(見圖3)；與β-catenin陰性表達(dá)患者比較，β-catenin陽性表達(dá)患者的復(fù)發(fā)率明顯升高(P<0.05)(見圖4)。

圖3 SOX1陽性及陰性表達(dá)患者腫瘤復(fù)發(fā)的Kaplan-Meier曲線;圖4 β-catenin陽性及陰性表達(dá)患者腫瘤復(fù)發(fā)的Kaplan-Meier曲線

2.5 早期胃癌患者腫瘤復(fù)發(fā)相關(guān)因素的Cox回歸模型分析以早期胃癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)為應(yīng)變量，以性別、年齡、T分期、分化程度、浸潤深度、SOX1及β-catenin表達(dá)為自變量，進(jìn)行Cox回歸分析可知：黏膜下浸潤、SOX1陰性表達(dá)是早期胃癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的危險因素(見表3)。

表3 早期胃癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)影響因素的Cox回歸分析

3 討論

胃癌是消化道最常見的惡性腫瘤之一，早期胃癌是指局限于黏膜或黏膜下層、伴或不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌，經(jīng)有效治療后的5年生存率為90%以上。近年來，ESD被越來越多地用于早期胃癌的治療，日本的研究認(rèn)為，ESD適用于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可能性極小的早期胃癌并將ESD作為早期胃癌內(nèi)鏡治療的標(biāo)準(zhǔn)方法[3]。ESD的優(yōu)勢在于能夠一次性完整切除直徑>2 cm的黏膜病變且切除深度包括黏膜全層、黏膜肌層及大部分黏膜下層，可以取得較為理想的組織學(xué)治愈性切除率并降低局部復(fù)發(fā)率。盡管如此，仍有一定比例的早期胃癌患者會發(fā)生ESD術(shù)后復(fù)發(fā)，需要尋找能夠早期預(yù)測腫瘤復(fù)發(fā)的標(biāo)志物。

SOX1是近年來發(fā)現(xiàn)的一類抑癌基因，在食管癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌中均呈異常表達(dá)[8-10]，但該基因在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用尚不明確。本研究選擇了未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的早期胃癌患者進(jìn)行研究，與正常胃黏膜組織比較，早期胃癌組織中SOX1的表達(dá)明顯減少且腫瘤分化程度越低、浸潤越深，SOX1的表達(dá)越少，表明SOX1的低表達(dá)與早期胃癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。進(jìn)一步隨訪402例早期胃癌患者的術(shù)后復(fù)發(fā)情況，共18例發(fā)生復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)率為4.47%，與白順滟等[4]報道的早期胃癌ESD術(shù)后復(fù)發(fā)率3.2%基本一致，與未復(fù)發(fā)患者比較，復(fù)發(fā)患者早期胃癌組織中SOX1的表達(dá)明顯減少且經(jīng)Kaplan-Meier曲線分析，與SOX1陰性表達(dá)患者比較，SOX1陽性表達(dá)患者的復(fù)發(fā)率明顯降低，表明SOX1的低表達(dá)與早期胃癌的術(shù)后復(fù)發(fā)有關(guān)，符合SOX1抑癌基因的特性。

胃癌相關(guān)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，SOX1對胃癌GES-1細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲均具有抑制作用且該作用與抑制β-catenin表達(dá)有關(guān)[6]。β-catenin是Wnt信號通路的核心分子，通過調(diào)節(jié)下游Cyclin D1、N-cadherin、MMP9等基因的表達(dá)來促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移、侵襲，在多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起到促癌作用[11-13]。口腔鱗癌及甲狀腺癌中的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，SOX1能夠抑制細(xì)胞中Wnt通路的激活，與SOX1抑制胃癌細(xì)胞中β-catenin表達(dá)的作用一致，表明SOX1通過靶向β-catenin發(fā)揮抑癌作用[14-15]。本研究對早期胃癌中β-catenin的分析表明，早期胃癌組織中β-catenin的表達(dá)高于正常胃黏膜組織且與SOX1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，表明β-catenin的高表達(dá)參與了早期胃癌的發(fā)生且低表達(dá)的SOX1可能通過增加β-catenin的表達(dá)在早期胃癌的發(fā)生、發(fā)展中起促癌作用，但SOX1靶向β-catenin影響胃癌生長的效應(yīng)仍需今后進(jìn)一步的動物實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。

惡性腫瘤病理特征的惡化與疾病預(yù)后、腫瘤復(fù)發(fā)、總生存期均有關(guān)，早期胃癌復(fù)發(fā)也與其病理特征有關(guān)[16-18]，國內(nèi)劉黎等[19]的研究報道了早期胃癌術(shù)后復(fù)發(fā)與浸潤深度有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)通過Cox模型分析了早期胃癌患者ESD術(shù)后復(fù)發(fā)的相關(guān)因素并發(fā)現(xiàn)，黏膜下浸潤及SOX1陰性表達(dá)是早期胃癌ESD術(shù)后復(fù)發(fā)的危險因素。其中，黏膜下浸潤與早期胃癌ESD術(shù)后復(fù)發(fā)相關(guān)的結(jié)果與劉黎的研究結(jié)果一致，而SOX1陰性表達(dá)與早期胃癌ESD術(shù)后復(fù)發(fā)相關(guān)的結(jié)果與SOX1的抑癌特性吻合。但在本實(shí)驗(yàn)的Cox模型中，未發(fā)現(xiàn)β-catenin陽性表達(dá)與早期胃癌ESD術(shù)后復(fù)發(fā)的相關(guān)性，可能因?yàn)镾OX1通過β-catenin以外的其他機(jī)制發(fā)揮抑癌作用，雖然β-catenin的高表達(dá)與早期胃癌的發(fā)生、病理特征惡化及SOX1的低表達(dá)有關(guān),但β-catenin并不直接參與早期胃癌遠(yuǎn)期病情的轉(zhuǎn)歸，在今后的研究中仍需進(jìn)一步探究SOX1影響早期胃癌復(fù)發(fā)的下游機(jī)制。

綜上所述，早期胃癌中SOX1的表達(dá)減少、β-catenin表達(dá)增加，SOX1的陰性表達(dá)與β-catenin通路激活、病理特征惡化有關(guān)，SOX1陰性表達(dá)是早期胃癌患者ESD術(shù)后復(fù)發(fā)的危險因素,對術(shù)后復(fù)發(fā)具有預(yù)測價值。