孫智強，李京濤，魏海梁，閆曙光，李日向，李 倩，常占杰

1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院肝病科，陜西 咸陽 712046； 2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)

由于肝臟和腸道解剖位置的特殊性，肝臟會受到大量腸道菌群及其代謝物(如脂多糖)引起的免疫反應(yīng)。為避免肝組織損傷，肝臟對這些物質(zhì)產(chǎn)生的免疫反應(yīng)具有重要的調(diào)節(jié)作用。過量脂肪、酒精或病毒引起的肝臟炎癥是損傷修復(fù)過程中重要組成部分。控制炎癥對促進組織再生或病原體的有效免疫反應(yīng)具有積極作用。然而，慢性炎癥和相關(guān)的組織損傷修復(fù)與纖維化，肝硬化和癌癥的發(fā)展密切相關(guān)。與其他外周器官相比，肝臟富含大量的天然免疫細(xì)胞，包括巨噬細(xì)胞、庫普弗細(xì)胞(KCs)、樹突狀細(xì)胞(DC)、自然殺傷細(xì)胞(NK)和自然殺傷T細(xì)胞(NKT)。NKT細(xì)胞在小鼠肝臟中表達(dá)豐富，是連接先天免疫和適應(yīng)性免疫的重要紐帶[1]，在炎癥反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用。由于NKT細(xì)胞2種亞型在免疫反應(yīng)中具有相反的作用，而免疫應(yīng)答是通過分泌促炎細(xì)胞因子和抗炎細(xì)胞因子介導(dǎo)的，因此，有必要區(qū)分它們在急性和慢性肝臟炎癥狀態(tài)中的不同作用。本文就NKT細(xì)胞在炎癥性肝病中的作用及免疫耐受的維持等方面研究作一概述。

1 NKT細(xì)胞

NKT細(xì)胞是一種天生的T細(xì)胞，除了典型的NK細(xì)胞標(biāo)志物外，還表達(dá)TCR-αβ鏈，在自身免疫性疾病、傳染病和癌癥等炎癥性疾病中具有重要的免疫調(diào)節(jié)作用[2]。NKT細(xì)胞是天然免疫和適應(yīng)性免疫之間的橋梁系統(tǒng)。NKT細(xì)胞可以通過主要組織的相容性復(fù)合物分子CD1d識別外源性和內(nèi)源性脂類抗原。使用基因敲入Cxcr6gfp/+小鼠的研究表明，α-半乳糖基神經(jīng)酰胺(αGalCer)注射后的幾分鐘內(nèi)，Ⅰ型NKT細(xì)胞遷移到肝竇內(nèi)增加[3]。NKT細(xì)胞在肝竇中的聚集表明，NKT細(xì)胞參與了各種免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)或逆轉(zhuǎn)肝臟炎癥的機制。

由于CD1d的限制性，將NKT細(xì)胞分為2種亞型：Ⅰ型NKT細(xì)胞即iNKT(invariant NKT)細(xì)胞和Ⅱ型NKT細(xì)胞即vNKT(variant NKT)細(xì)胞。iNKT細(xì)胞較vNKT細(xì)胞在小鼠體內(nèi)多，約占小鼠肝內(nèi)淋巴細(xì)胞的50%。iNKT細(xì)胞表達(dá)恒定不變的TCR-αβ，該基因主要由生殖細(xì)胞Vα基因(人Vα24，小鼠Vα14)和Jα18基因片段與一組更為多樣的非生殖細(xì)胞Vβ基因(小鼠Vβ8.2、Vβ7或Vβ2和人Vβ11)組成[4]。在人體中，iNKT細(xì)胞約占循環(huán)T細(xì)胞的0.1%～1%。CD4-和CD4+iNKT細(xì)胞主要分泌Th1型和Th2型細(xì)胞因子。vNKT細(xì)胞比iNKT細(xì)胞表達(dá)更豐富，表達(dá)的TCR-α-和TCR-β鏈相對復(fù)雜。vNKT細(xì)胞中有一種主要的細(xì)胞亞群是與β連接的自糖脂硫化物反應(yīng)，它表達(dá)了一個寡克隆TCR序列，主要是利用Vα3/Vα1-Jα7/Jα9和Vβ8.1/Vβ3.1-Jβ2.7基因片段[5]。從iNKT細(xì)胞TCR-αGalCer/CD1d復(fù)合物和vNKT細(xì)胞TCR-硫化物/CD1d復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)，不同的分子基序在iNKT和vNKT細(xì)胞的識別中起著重要作用[6-7]。

1.1 iNKT細(xì)胞抗原識別與活化iNKT細(xì)胞能被小鼠體內(nèi)多種糖脂抗原以CD1d依賴的方式激活，如αGalCer和異氯三己糖神經(jīng)酰胺。除脂類抗原外，iNKT細(xì)胞還可通過Toll樣受體(TLR)介導(dǎo)的信號和活化抗原提呈細(xì)胞(APC)分泌的細(xì)胞因子(IL-12、IL-18或IFN)而激活。活化后的iNKT細(xì)胞可分泌Th1-、Th2或Th17等細(xì)胞因子。因此，根據(jù)組織環(huán)境、APC和脂類抗原，iNKT細(xì)胞可以分泌不同的細(xì)胞因子譜。如iNKT細(xì)胞在缺血、毒素誘導(dǎo)的損傷或IL-18和IL-12的刺激下分泌IFN-γ；在αGalCer的刺激下分泌IFN-γ、IL-4和IL-17[8]。

活化后的iNKT細(xì)胞可進一步刺激DC細(xì)胞、NK細(xì)胞、B細(xì)胞及常規(guī)CD4+和CD8+T細(xì)胞，從而進一步介導(dǎo)肝臟損傷[9]?；罨膇NKT細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子和趨化因子可導(dǎo)致中性粒細(xì)胞、髓系細(xì)胞和單核細(xì)胞向肝臟聚集[10-12]。iNKT細(xì)胞可促進與Hedgehog通路有關(guān)纖維生成和骨橋蛋白(OPN)在內(nèi)的細(xì)胞因子導(dǎo)致的肝星狀細(xì)胞(HSC)活化[11]?；罨膇NKT細(xì)胞可以通過Fas/FasL相互作用直接致肝細(xì)胞死亡，也可以通過激活NK細(xì)胞間接損傷肝細(xì)胞[13]。KCs位于門靜脈(竇血管間隙)和系統(tǒng)循環(huán)的交界處，通過TLR和核苷酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域樣受體的表達(dá)，可識別病原體相關(guān)分子模式和危險相關(guān)分子模式，激活免疫反應(yīng)的關(guān)鍵因素?；罨腒Cs產(chǎn)生多種促炎細(xì)胞因子，如IL-1β、IL-18、TNF-α和IL-12，它們在調(diào)節(jié)iNKT細(xì)胞的聚集和活化中具有重要作用[14]。

1.2 vNKT細(xì)胞抗原識別與活化vNKT細(xì)胞主要由自身糖脂硫化物和β連接的糖脂而激活。其他磷脂，包括溶血磷脂酰膽堿、溶血磷脂和溶血素-血小板活化因子，也可在體外和體內(nèi)通過CD1d依賴的方式刺激vNKT細(xì)胞的活化[15]。如感染HBV后肝細(xì)胞產(chǎn)生的溶血磷脂酰乙醇胺能夠刺激vNKT細(xì)胞的激活[16]。iNKT細(xì)胞在肝臟損傷中主要發(fā)揮促炎作用，vNKT細(xì)胞能夠抑制iNKT細(xì)胞誘導(dǎo)的促炎反應(yīng)，從而保護肝臟免受損傷。此外，硫化物激活vNKT細(xì)胞并不能誘導(dǎo)B細(xì)胞、NK細(xì)胞或T細(xì)胞的活化[17]。因此，對vNKT細(xì)胞的研究揭示了一種主要的免疫調(diào)節(jié)途徑，該途徑證明vNKT細(xì)胞對肝臟缺血再灌注損傷具有保護作用。

1.3 iNKT和vNKT細(xì)胞間的交叉調(diào)節(jié)iNKT細(xì)胞在酒精、高脂飲食、缺血或腸源性微生物引起肝臟損傷后迅速激活。肝內(nèi)APC(如KCs)和TLRs/細(xì)胞因子介導(dǎo)其活化，從而導(dǎo)致細(xì)胞因子/趨化因子依賴性的髓系細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的聚集，并激活HSC和NK細(xì)胞[2]。這些細(xì)胞相互作用導(dǎo)致脂肪變性，纖維化和肝細(xì)胞壞死，甚至影響肝癌發(fā)生、發(fā)展。vNKT細(xì)胞在自身脂質(zhì)的產(chǎn)生后可被激活，導(dǎo)致交叉調(diào)節(jié)途徑的誘導(dǎo)，抑制iNKT細(xì)胞，使iNKT細(xì)胞功能喪失，阻斷炎癥級聯(lián)和肝病的發(fā)生。相反，有實驗數(shù)據(jù)表明iNKT可交叉調(diào)節(jié)vNKT活性。研究發(fā)現(xiàn)，硫化刺激vNKT細(xì)胞可完全抑制αGalCer在15～12 RM纖維肉瘤模型中的保護作用，但不完全阻斷αGalCer對CT 26結(jié)腸癌肺轉(zhuǎn)移的保護作用，iNKT細(xì)胞可能對vNKT細(xì)胞的活性有中度抑制作用[18]。更好地理解iNKT和vNKT細(xì)胞交叉調(diào)控機制對于炎癥性肝病免疫反應(yīng)結(jié)果的研究至關(guān)重要。

2 NKT細(xì)胞在肝臟病理狀態(tài)中的作用

在大多數(shù)慢性肝病的實驗?zāi)Ｐ椭?，包括肝臟缺血再灌注損傷、conA型肝炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)和非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)，iNKT細(xì)胞已被證實具有促進肝臟疾病發(fā)生、發(fā)展的作用。然而，在急性肝損傷模型中，iNKT細(xì)胞具有保護作用。如在小鼠膽道梗阻、膽汁淤積模型和急性CCl4誘導(dǎo)的纖維化模型中，iNKT細(xì)胞依賴性地抑制巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-2、KCs和TNFα的產(chǎn)生，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞浸潤和肝損傷的發(fā)生、發(fā)展[19-20]。這些數(shù)據(jù)表明，在急性肝損傷時，iNKT細(xì)胞激活可能具有保護作用，而在慢性疾病中，iNKT細(xì)胞激活可導(dǎo)致肝臟損傷。Wang等[21]發(fā)現(xiàn)，αGalCer介導(dǎo)的iNKT細(xì)胞的激活通過STAT-6方式促進中性粒細(xì)胞浸潤和肝炎發(fā)生，而又能依賴STAT-1通路誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞凋亡來改善iNKT肝炎。

2.1 酒精性肝病酒精性肝病(ALD)是由長期酗酒引起的一種常見疾病，也是一般人群中最常見的死亡原因之一。本病可從肝脂肪變性(脂肪肝)發(fā)展為酒精性肝炎(10%～35%)，并最終發(fā)展為酒精性肝纖維化或肝硬化(8%～20%)。ALD的細(xì)胞和分子機制涉及天然免疫細(xì)胞(NK、NKT和γδT細(xì)胞)、實質(zhì)細(xì)胞(肝細(xì)胞)和非實質(zhì)細(xì)胞(竇內(nèi)皮細(xì)胞、KCs、HSCs和DC)之間的復(fù)雜相互作用。飲酒后，通過脂多糖/TLR信號依賴機制激活KCs，導(dǎo)致多種促炎細(xì)胞因子和趨化因子的分泌增加，此外還會產(chǎn)生類二十烷酸和活性氧。Cui等[14]發(fā)現(xiàn)，KCs衍生的炎性小體激活和IL-1β釋放對于肝NKT細(xì)胞的聚集和激活是必不可少的?？傊?，腸源性細(xì)菌及其代謝物，可通過核苷酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域樣受體來激活KCs，從而導(dǎo)致NKT細(xì)胞活化。

在Lieber-DeCarli液體喂養(yǎng)的慢性+暴飲酒精的小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，iNKT細(xì)胞數(shù)量顯著增加，這與另一種通過胃管喂食酒精的小鼠模型得出的結(jié)果一致[10，12]。此外，Jα18-/-小鼠(缺乏iNKT細(xì)胞)和CD1d-/-小鼠(缺乏NKT細(xì)胞亞群)對酒精攝入后的肝損傷具有保護作用。Ⅰ型NKT細(xì)胞的活化是Gr-1+CD11b+細(xì)胞和中性粒細(xì)胞募集所必需的，這些細(xì)胞會導(dǎo)致肝組織損傷。因此，幾種與炎癥和中性粒細(xì)胞聚集有關(guān)的細(xì)胞因子和趨化因子，包括OPN、IL-1β、IL-6、TNFα、巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-2、MIP-1β和CXCR1在酒精性野生型小鼠肝臟中表達(dá)增強，而在缺乏iNKT細(xì)胞的小鼠中則無表達(dá)。此外，通過全反式維甲酸直接抑制iNKT細(xì)胞，或通過硫化物介導(dǎo)激活vNKT細(xì)胞的間接機制或注射抗CD1d阻斷抗體，顯著抑制了這種促炎級聯(lián)，改善了ALD[10，12]。

2.2 NAFLDNAFLD是最常見的慢性肝病。NAFLD影響發(fā)達(dá)國家10%～20%的人口，而且隨著糖尿病和肥胖癥的增加，其發(fā)病率也在增加。NAFLD的定義是脂肪在肝臟內(nèi)的異常積聚，即脂肪變性，可發(fā)展為嚴(yán)重的炎癥細(xì)胞浸潤或伴有纖維化或壞死的非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，或進展為肝硬化和肝細(xì)胞癌(HCC)。NKT細(xì)胞通過CD1d-脂質(zhì)抗原識別被激活，導(dǎo)致肝臟炎癥和NASH。高脂飲食誘導(dǎo)的脂肪肝增加了KCs的數(shù)量，增加了KCs中促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，導(dǎo)致NKT細(xì)胞在NAFLD發(fā)展過程中過度活化和細(xì)胞死亡，從而導(dǎo)致肝NKT細(xì)胞的耗竭。此外，NKT細(xì)胞的過繼性轉(zhuǎn)移降低了肝臟脂肪含量，隨后導(dǎo)致ob/ob小鼠從宏觀到微觀的轉(zhuǎn)變，并改善了葡萄糖耐量[22]。通過觀察MCD誘導(dǎo)小鼠NASH過程中肝NKT細(xì)胞的蓄積，Hedgehog通路的激活介導(dǎo)NKT細(xì)胞的激活，從而促進HSC的肌纖維母細(xì)胞活化，導(dǎo)致NASH的纖維化進展[23]。

2.3 自身免疫性肝炎(AIH)AIH是一種慢性自身免疫性肝臟炎癥，其特點是T細(xì)胞在無其他肝病的情況下肝小葉內(nèi)浸潤，并伴有血清轉(zhuǎn)氨酶、高伽馬球蛋白血癥和肝細(xì)胞特異性自身抗體的增加。AIH有2種亞型：Ⅰ型為抗平滑肌抗原和抗核抗體的自身抗體，Ⅱ型為針對細(xì)胞色素P450 D26或甲?；D(zhuǎn)移酶環(huán)脫氨酶的自身抗體。早期的研究發(fā)現(xiàn)，iNKT細(xì)胞具有致病性，而vNKT細(xì)胞的激活對ConA所致的肝炎具有保護作用[24]。PBC和AIH患者血清和肝臟中IL-17的高水平與疾病的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，這表明iNKT細(xì)胞分泌的IL-17在肝臟疾病中具有一定的作用[25-26]。與對照組相比，PBC、慢性丙型肝炎、NASH和AIH患者肝活檢門脈區(qū)的IL-17表達(dá)細(xì)胞明顯增加[27]。在αGalCer引起的肝損傷小鼠模型中，CD4+iNKT細(xì)胞是IL-17的主要來源，在注射αGalcer前注射抗IL-17和單克隆抗體可明顯加重肝炎、中性粒細(xì)胞的肝合成及促炎單核細(xì)胞IL-12和TNF-α的產(chǎn)生。與此形成對照的是，在注射αGalCer之前，外源性重組小鼠IL-17可以減輕肝炎并防止炎癥單核細(xì)胞進入肝臟。因此，iNKT細(xì)胞分泌IL-17可能在AIH中起關(guān)鍵作用[28]。

2.4 慢性乙型肝炎(CHB)HBV感染在全世界肝硬化和原發(fā)性肝癌中占57%，每年造成100萬人死亡。iNKT細(xì)胞可能在控制HBV感染中起著重要作用，特別是在HBV感染的早期階段，通過IFN-γ的分泌，iNKT細(xì)胞可以抑制肝細(xì)胞中的HBV病毒復(fù)制[29]。肝細(xì)胞通過調(diào)節(jié)CD1d分子所呈現(xiàn)的激活和非激活脂質(zhì)的平衡，直接調(diào)控iNKT細(xì)胞的動態(tài)平衡。因此，iNKT細(xì)胞作為HBV感染的早期預(yù)警系統(tǒng)，很大程度上改變了脂質(zhì)代謝[7]。例如，vNKT細(xì)胞識別CD1d結(jié)合的溶血磷脂，一種由HBV誘導(dǎo)的分泌磷脂酶在肝細(xì)胞中產(chǎn)生的抗原性自身脂質(zhì)，產(chǎn)生的vNKT細(xì)胞的活化導(dǎo)致IL-12介導(dǎo)的iNKT細(xì)胞的反活化，在病毒的控制中起著關(guān)鍵的作用[16]。然而，vNKT細(xì)胞也可引起HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟損傷[30]。因此，NKT細(xì)胞在感染早期可以控制HBV病毒的復(fù)制，但NKT細(xì)胞也可通過肝細(xì)胞溶解、促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生、誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡和抑制肝細(xì)胞增殖等多種機制參與慢性病毒性肝炎的肝損傷。

2.5 HCCHCC常與慢性炎癥性肝病如NASH和病毒性肝炎有關(guān)。NKT細(xì)胞在癌癥中具有雙重作用：NKT細(xì)胞可以通過激活效應(yīng)分子CD4/CD8+T細(xì)胞來促進抗腫瘤反應(yīng)；還可以通過募集抑制因子或調(diào)節(jié)性T細(xì)胞誘導(dǎo)耐受或產(chǎn)生Th2細(xì)胞因子來加速腫瘤的生長，從而抑制腫瘤抗原特異性CD8+T細(xì)胞的增殖[31]。雖然NKT細(xì)胞在肝臟中大量存在，但很少有研究試圖闡明其在肝癌中的作用。

研究表明，長期喂飼膽堿缺乏高脂飲食(CD-HFD)可誘導(dǎo)小鼠肝內(nèi)CD8+T細(xì)胞和NKT細(xì)胞的活化，以及炎性細(xì)胞因子的分泌。NKT細(xì)胞只會引起脂肪變性，而CD8+細(xì)胞和NKT細(xì)胞協(xié)同作用會導(dǎo)致肝臟的損傷。肝細(xì)胞TLR4和典型的核因子-κB信號傳導(dǎo)促進NASH到HCC的轉(zhuǎn)變，表明NASH和肝癌的發(fā)生與不同的分子機制有關(guān)。CD4+iNKT細(xì)胞可通過抑制致癌β-catenin通路激活所引起的炎癥反應(yīng)而介導(dǎo)抗腫瘤作用。此外，NKT細(xì)胞對肝癌轉(zhuǎn)移瘤的生長也有抑制作用[32]。NKT細(xì)胞在腫瘤免疫中的確切作用還存在爭議，其功能需進一步驗證。明確NKT細(xì)胞在不同病因及不同階段肝癌細(xì)胞中的功能，有助于NKT細(xì)胞相關(guān)治療更好地應(yīng)用于患者。

3 展望

本文討論了NKT細(xì)胞活化的關(guān)鍵方面及其在炎癥條件下的作用。目前，對NKT細(xì)胞研究主要集中于動物實驗，缺乏臨床研究。由于CD1d限制性，NKT細(xì)胞存在2種亞型，它們具有相反的功能，并且在疾病發(fā)展過程中可以在不同的時間點被不同的激活，這使得實驗和臨床研究變得更加復(fù)雜。不同類型的NKT細(xì)胞活化可導(dǎo)致多種細(xì)胞因子和趨化因子的分泌。此外，由于NKT細(xì)胞還調(diào)節(jié)其他關(guān)鍵免疫細(xì)胞的活性，如KCs、巨噬細(xì)胞、DC和主要的組織相容性復(fù)合體—限制CD4+/CD8+細(xì)胞，因此，對這些交叉調(diào)節(jié)影響的分子理解將是了解肝臟如何在免疫耐受和免疫之間保持平衡的關(guān)鍵。在慢性肝病的過程中，不同NKT細(xì)胞的作用是不可分割的、相互關(guān)聯(lián)的，并且隨著病情的發(fā)展而變化。在未來，我們的重點是研發(fā)特異性試劑來明確和鑒別人類的Ⅰ型和Ⅱ型NKT細(xì)胞亞群，并通過CD1d四聚體和其他方法區(qū)分在外周血單個核細(xì)胞和肝組織中的NKT激活試劑。