慎佩晶，張宇飛，李喜蓮，徐洋，程海華，陳雪峰

(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水漁業(yè)健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室浙江省淡水水產(chǎn)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 浙江省淡水水產(chǎn)研究所，浙江 湖州 313001)

羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)，又稱大頭蝦、馬來西亞大蝦，隸屬于節(jié)肢動物門，軟甲綱，十足目，長臂蝦科，沼蝦屬，原產(chǎn)于東南亞，是目前世界上重要的淡水養(yǎng)殖蝦類之一，也是世界上最大的淡水蝦。它在水生態(tài)系統(tǒng)中分布較廣，在淡水區(qū)域(如江河、湖泊)和半咸水區(qū)域(如河口)均有分布，對水環(huán)境中的理化指標(biāo)變化反應(yīng)較敏感[1]。它具有生長速度快、食性較廣、生長周期短和抗病能力強(qiáng)等特點(diǎn)，自1976年該蝦引入我國以來，已在浙江、江蘇、上海、廣東、廣西、湖南、湖北等十多個省市自治區(qū)養(yǎng)殖推廣。

目前,用于蝦類遺傳多樣性研究的分子標(biāo)記方法較多。限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)[2]、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)[3]、簡單重復(fù)序列標(biāo)記(SSR)[4]、ISSR[5]、EST-SSR[6]、相關(guān)序列多態(tài)性(SRAP)[7]、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(AFLP)[8]等多種標(biāo)記技術(shù)已在蝦類多樣性研究中被采用。其中SSR由2～6個核苷酸為重復(fù)單元組成的DNA序列，在真核生物的基因組中分布廣泛。這一序列具有共顯性、多態(tài)性相對豐富、基因組覆蓋高等優(yōu)點(diǎn)。該技術(shù)具有易于操作、周期短、等位基因多樣性高和穩(wěn)定性高等特點(diǎn)[9]，使得SSR標(biāo)記成為基因組研究中的一種主要的分子標(biāo)記，被廣泛用于遺傳圖譜構(gòu)建[10]、品種鑒定[11]、輔助選擇育種[12]、親緣關(guān)系鑒定[13]、遺傳多樣性分析[14]和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)[15]等研究中。SSR技術(shù)也在羅氏沼蝦上得到廣泛應(yīng)用。王傳聰?shù)萚16]對羅氏沼蝦肝胰腺組織轉(zhuǎn)錄組測序共檢測出15 356個SSR位點(diǎn)。蔣飛等[17]應(yīng)用SSR標(biāo)記對羅氏沼蝦5個選擇系子二代共630尾蝦的遺傳多樣性和遺傳分化進(jìn)行了研究。戴習(xí)林等[18]利用SSR對羅氏沼蝦3個養(yǎng)殖群體進(jìn)行遺傳多樣性分析，并探討了最適宜的樣本量及標(biāo)記量。

本研究選用5個群體127份羅氏沼蝦樣品，對羅氏沼蝦種質(zhì)進(jìn)行SSR分子標(biāo)記遺傳多樣性分析，可以有效挖掘特異的羅氏沼蝦種質(zhì)材料，促進(jìn)種質(zhì)材料的有效利用，這對改良現(xiàn)有品種，提高羅氏沼蝦產(chǎn)量和品質(zhì)，具有極其重要的意義，也為分子標(biāo)記輔助育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

試驗(yàn)材料為羅氏沼蝦南太湖2號，從緬甸與孟加拉引種的緬甸群體和孟加拉群體，2018年新引進(jìn)的以色列超雌蝦和泰國蝦群體，取自浙江省淡水水產(chǎn)研究所羅氏沼蝦長興保種基地。其中，南太湖2號為連續(xù)第10代選育的核心群，緬甸群體為從緬甸引進(jìn)的野生種經(jīng)馴化養(yǎng)殖的第5代，孟加拉群體為從孟加拉引進(jìn)野生種經(jīng)馴化養(yǎng)殖的第7代。

分別從以色列群體(I)、緬甸群體(R)、孟加拉群體(B)、核心群體(C)、泰國群體(T)中隨機(jī)選取8、30、28、30、31個羅氏沼蝦個體，采集其腹部肌肉置于無水乙醇中固定，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因組DNA提取

羅氏沼蝦肌肉組織基因組DNA提取采用天根生物公司植物基因組提取試劑盒(DP320)[17]，具體步驟按說明書進(jìn)行。采用NanoDrop2000C分光光度計檢測DNA質(zhì)量和濃度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 微衛(wèi)星引物設(shè)計與合成

9對微衛(wèi)星引物均為本實(shí)驗(yàn)室自行開發(fā)的SSR引物(表1)，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，并在正向引物5′端添加FAM熒光標(biāo)記。

表1 微衛(wèi)星引物的信息

1.4 PCR擴(kuò)增

以這9對引物分別對127個樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為20 μL：10×buffer 2 μL，dNTPs(2.5 mmol·L-1)0.5 μL，熒光引物(10 μmol·L-1)各1 μL，DNA模板約50 ng，Taq酶(5 U·μL-1)0.5 μL，加ddH2O至20 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，合適的退火溫度下退火30 s，72 ℃延伸30 s(35個循環(huán))；72 ℃延伸7 min。各對引物的最適退火溫度通過梯度PCR試驗(yàn)確定。PCR產(chǎn)物純化后，在乙醇已經(jīng)揮發(fā)完全的板中加入內(nèi)標(biāo)LIZ500和HiDi，振蕩充分混勻，瞬時離心以除去管壁樣品。放入PCR儀，95 ℃ 4 min變性。SSR-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物放到3730XL中進(jìn)行毛細(xì)管電泳。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

使用Gene Mapper V3.0軟件對基因掃描文件進(jìn)行分析，記錄每個位點(diǎn)的相對分子質(zhì)量大小，得到相應(yīng)的位點(diǎn)的片段大小和信號值。根據(jù)ROX-500標(biāo)準(zhǔn)，自動校準(zhǔn)尺寸和峰值。采用Popgen1.32軟件計算微衛(wèi)星座位的有效等位基因數(shù)(Ne)、等位基因數(shù)(Na)、表觀雜合度(Ho)、Shannon’s信息指數(shù)(I)、期望雜合度(He)、基因流(Nm)、多態(tài)信息含量(polymorphism information content，PIC)、F-統(tǒng)計量(Fis、Fit、Fst)、群體遺傳距離等相關(guān)參數(shù)，并構(gòu)建UPGMA聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 9個微衛(wèi)星座位遺傳多態(tài)性

采用篩選出的9對引物對127份羅氏沼蝦種質(zhì)材料的遺傳多樣性進(jìn)行分析，9對引物均具有多態(tài)性，擴(kuò)增出的條帶在137～301 bp(如圖1為引物11206在羅氏沼蝦1、16、28號樣品中的擴(kuò)增結(jié)果)，共檢測到70個等位位點(diǎn)，每個引物檢測到5～10個，平均為7.777 8個。其中，引物4179檢測到的等位位點(diǎn)最多，有10個；引物168970檢測的等位位點(diǎn)次之，有9個。

圖1 引物11206在羅氏沼蝦1、16、28號樣品中的基因分型

各座位的表觀雜合度在0.149 6～0.637 8，群體均值為(0.325 6±0.173 6)；期望雜合度在0.362 2～0.850 4，群體均值為(0.674 4±0.173 6)；9對引物的多態(tài)信息量在0.607 4～0.844 9，平均值為0.828 0，其中引物168970的多態(tài)信息量最高，為0.844 9，引物10049的多態(tài)信息量最低，僅為0.607 4。9對引物的PIC均大于0.5，說明這些標(biāo)記能提供較高可信度的信息(表2)。

表2 羅氏沼蝦5個地理群體9個微衛(wèi)星位點(diǎn)的遺傳多樣性

2.2 群體內(nèi)遺傳多態(tài)性

9對SSR引物均擴(kuò)增出清晰的條帶，羅氏沼蝦種質(zhì)資源的等位基因(Na)平均為2.777 8～6.666 7。以色列群體最少，泰國群體最多，5個種質(zhì)資源總體等位基因數(shù)平均為5.044 5。有效等位基因(Ne)平均為2.078 8～3.930 5；以色列群體最少，泰國群體最多，5個種質(zhì)來源總體平均為3.131 4。5個群體PIC值平均在0.453 7～0.548 3，以色列群體最低，泰國群體最高。PIC為衡量基因變異程度高低的多態(tài)性信息量指標(biāo)[19]，PIC>0.50時，該引物為高度多態(tài)性信息引物；0.25≤PIC≤0.50時，該引物為中度多態(tài)性信息引物；當(dāng)PIC<0.25時，該引物為低度多態(tài)性信息引物。核心群體及泰國群體具有較高的遺傳多樣性；以色列群體、緬甸群體和孟加拉群體具有中度的遺傳多樣性(表3)。

表3 羅氏沼蝦5個群體的遺傳多樣性

2.3 微衛(wèi)星座位遺傳分化

對羅氏沼蝦5個群體的Fit、Fis、Nm統(tǒng)計顯示，F(xiàn)is在微衛(wèi)星位點(diǎn)12759、112473和168970上表現(xiàn)為正值，分別為0.162 9、0.093 7和0.411 9，其余位點(diǎn)均為負(fù)值，總體平均為-0.079 3。Fit在位點(diǎn)4179、10049、11206和51708為負(fù)值，分別是-0.136 8、-0.221 0、-0.007 0和-0.312 8，平均值為0.105 8。各位點(diǎn)的基因流(Nm)在0.661 5～4.406 0，其中≥1的位點(diǎn)有7個(4179、10049、11206、51708、75401、14405和168970)，占所有檢測位點(diǎn)的77.78%，均值為1.207 7(表4)。

表4 微衛(wèi)星座位的F值和基因流

2.4 群體間遺傳距離

5個群體間遺傳距離范圍在0.227 6～1.001 2，其中遺傳距離最大的是孟加拉群體與以色列群體之間的距離為1.001 2；遺傳距離最小的為孟加拉群體與核心群體之間的距離為0.227 6；平均遺傳距離為0.619 4(表5)，這與前人的研究結(jié)果[20]相比，本研究的遺傳多樣性更為豐富。這可能與本研究采集的群體樣品來源地跨度大、分布廣有關(guān)。

表5 Nei氏遺傳距離和遺傳相似性

2.5 群體遺傳結(jié)構(gòu)

采用Popgen1.32軟件，對5個群體的微衛(wèi)星遺傳多樣性進(jìn)行分析，以遺傳相似系數(shù)為基礎(chǔ)進(jìn)行UPGMA聚類，繪制的遺傳聚類樹狀圖能直觀表現(xiàn)個體間親緣。由圖2可知，孟加拉群體與核心群體首先聚為一支，再與以色列群體與緬甸群體聚成的一支聚合，聚類最遠(yuǎn)的為泰國群體。

圖2 羅氏沼蝦5個群體的UPGMA聚類

3 討論

種質(zhì)資源是育種的基礎(chǔ)，育種材料的遺傳多樣性能提高育種水平，作為種質(zhì)評價和利用的基礎(chǔ)。遺傳多樣性是物種長期生存和保持進(jìn)化的基礎(chǔ)[21]，也可為基因資源的發(fā)掘提供必要的信息[22]。群體遺傳結(jié)構(gòu)的研究對物種的保護(hù)、利用和改良具有重要的理論和實(shí)踐意義。

我國自1976年引進(jìn)羅氏沼蝦，由于長期近親間和在有限的小群體交配繁殖，使這些羅氏沼蝦種群基因流失，出現(xiàn)退化現(xiàn)象，抗病性與生長能力都在降低[23]。因此，對羅氏沼蝦的群體遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性的研究成為確定優(yōu)先保護(hù)種群、有效的取樣策略和近交衰退種群的恢復(fù)策略的制定都有極為重要的意義[24-25]。周勁松[26]對羅氏沼蝦緬甸引進(jìn)種和浙江本地種及其雜交種進(jìn)行SRAP分析，并利用RAPD技術(shù)分析了羅氏沼蝦單對交配親本及F1代的遺傳關(guān)系及分離規(guī)律。李明云等[27]利用RAPD技術(shù)，對浙江省羅氏沼蝦養(yǎng)殖群體和緬甸群體的遺傳差異進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)緬甸自然群體與浙江養(yǎng)殖群體遺傳距離為0.184 5。甘西等[23]采用RAPD技術(shù)，對馬來西亞引進(jìn)后代的養(yǎng)殖群體(簡稱NY)和新加坡F1代與養(yǎng)殖群體交配繁殖的后代(簡稱NX)的遺傳多樣性進(jìn)行了研究，Nx群體內(nèi)的遺傳變異度明顯高于Ny群體。

本研究采用9對SSR引物對羅氏沼蝦5個群體的127個樣品進(jìn)行遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)分析，共得到70個等位位點(diǎn)，平均多態(tài)信息含量(PIC)為0.828 0；群體結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，5個種群遺傳變異豐富，可以為新品種的創(chuàng)制提供幫助。