許凱倫，馬建忠，胡園，徐匯鑌，王芳，鄭伊諾，吳越

(浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所，浙江 溫州 325005)

哈維氏弧菌是石斑魚(Epinephelusspp.)養(yǎng)殖過程中主要的致病菌之一，可引起石斑魚的皮膚潰瘍癥、突眼癥[1-3]，嚴(yán)重影響了養(yǎng)殖效益。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，藥物防治仍然是控制哈維氏弧菌最直接有效的手段。噁喹酸作為一種水產(chǎn)專用抗菌類藥物，具有廣譜、高效、低毒的特點(diǎn)，是水產(chǎn)專用抗菌類藥物。已有學(xué)者對(duì)噁喹酸在大西洋庸鰈(Hippog-lossushippoglossus)、歐洲鰻鱺(Anguillaanguilla)和凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)等[4-6]多種水產(chǎn)品中的代謝規(guī)律進(jìn)行研究。噁喹酸在水產(chǎn)動(dòng)物中的基礎(chǔ)代謝已有較多報(bào)道，但多是在健康動(dòng)物中進(jìn)行研究，而在患病動(dòng)物中的臨床藥代謝研究很少。本文通過構(gòu)建石斑魚哈維氏弧菌人工感染模型，比較噁喹酸在健康和感染哈維氏弧菌石斑魚體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特征，并結(jié)合哈維氏弧菌對(duì)噁喹酸的體外藥敏實(shí)驗(yàn)，以期為噁喹酸在水產(chǎn)臨床的應(yīng)用制定科學(xué)合理的給藥方案提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)石斑魚及菌株

健康石斑魚體重為(500±50)g，于浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所洞頭基地養(yǎng)殖，養(yǎng)殖水溫為(25±3)℃。隨機(jī)抽取該基地的石斑魚進(jìn)行檢測，未發(fā)現(xiàn)噁喹酸存在，養(yǎng)殖期間所投喂飼料均不含噁喹酸。

1.2 實(shí)驗(yàn)菌株

11株哈維氏弧菌H1～H11，由本單位自溫州地區(qū)發(fā)生病害的養(yǎng)殖海水魚類、蝦類和貝類體內(nèi)分離保存，均已做過生化鑒定和16S rRNA測序。

1.3 哈維氏弧菌人工感染石斑魚

石斑魚的哈維氏弧菌侵染和半致死劑量實(shí)驗(yàn)參考林克冰等[7]的方法，將菌株接種于2216E培養(yǎng)基28 ℃培養(yǎng)18～24 h，用無菌生理鹽水稀釋得到濃度為2×109mL-1的哈維氏弧菌混懸液，備用。將混懸液和生理鹽水以1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32的比例梯度配制侵染液進(jìn)行腹腔注射感染，健康組注射無菌生理鹽水。本實(shí)驗(yàn)設(shè)置2次生物學(xué)重復(fù)，每次重復(fù)選取5尾石斑魚，每尾石斑魚的注射量為0.3 mL。各處理組石斑魚連續(xù)觀察2周，記錄死亡情況。

1.4 LD50的測定和細(xì)菌分離

LD50的測定參照Reed-Muench[8]的方法，計(jì)算公式為：lg LD50=algb+c；a為距離比例，a=(高于50%死亡率-50%)/(高于50%死亡率-低于50%死亡率)；b為稀釋系數(shù)，本實(shí)驗(yàn)的稀釋系數(shù)為2-1；c為高于50%死亡率的最小濃度的對(duì)數(shù)。選擇人工感染后瀕死且有典型癥狀的石斑魚進(jìn)行病原菌的分離鑒定，于超凈臺(tái)上用無菌接種環(huán)挑發(fā)病組織接種于硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(TCBS)上在28 ℃下分離培養(yǎng)12 h，挑取形態(tài)、色澤較一致的優(yōu)勢菌落劃線進(jìn)行純化培養(yǎng)3次。挑取純化后的單菌落接種于2216E液體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)過夜，檢索《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》進(jìn)行菌株生理生化鑒定，所用的生化鑒定試劑購買自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.5 石斑魚給藥

以LD50哈維氏弧菌混懸液腹腔注射石斑魚，待魚體有明顯癥狀時(shí)肌肉注射噁喹酸作為感染組，另設(shè)健康石斑魚作為對(duì)照組。噁喹酸注射用藥液的配制參考梁增輝[9]的方法，稱取噁喹酸1.500 g，溶解于0.1 mol·L-1氫氧化鈉溶液，用6 mol·L-1鹽酸調(diào)節(jié)pH至10.5，用0.9%氯化鈉水溶液定容至100 mL，配制成終濃度為15 g·L-1的注射用藥液，以20 mg·kg-1魚體重進(jìn)行肌肉注射給藥。

1.6 藥動(dòng)學(xué)研究

1.6.1 樣本收集

分別取給藥后0、0.5、1、2、4、8、12、24、48、72和96 h的健康組和感染組石斑魚各3尾采集尾靜脈血于含有1%肝素鈉的離心管中，離心分離血漿并于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2 血漿中噁喹酸的測定

血樣前處理參考王慧[10]的方法，取樣品1 mL于25 mL離心管中，加入乙酸乙酯20 mL，無水硫酸鈉1 g，超聲提取5 min。3 000 r·min-1離心10 min后，上清液轉(zhuǎn)入50 mL茄形瓶中。于50～55 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，迅速加入1 mL流動(dòng)相溶解，再加入1 mL正己烷于漩渦混合器上充分振蕩，轉(zhuǎn)入5 mL離心管中，3 000 r·min-1離心5 min，取下層清液，用0.22 μmol·L-1的針式濾器過濾至進(jìn)樣瓶中。用高效液相色譜法測定噁喹酸在各樣本中的游離藥物濃度，具體色譜條件如下：色譜柱：安捷倫C18；流動(dòng)相：1%甲酸水溶液-乙腈(70+30)；流速：1.0 mL·min-1；檢測器波長：激發(fā)波長312 nm，發(fā)射波長366 nm;進(jìn)樣量50 μL。

1.6.3 數(shù)據(jù)處理

健康組和感染組石斑魚血漿中噁喹酸的藥時(shí)數(shù)據(jù)使用藥代動(dòng)力學(xué)軟件winNonln 5.2.1進(jìn)行房室模型擬合并計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，藥時(shí)曲線用Excel 2013繪制。

1.7 藥敏分析

藥敏實(shí)驗(yàn)操作參考吳立婷等[11]實(shí)驗(yàn)方法，挑取單菌落接種到水解酪蛋白培養(yǎng)基中，于35 ℃振蕩培養(yǎng)6～8 h。將新鮮菌液濃度用無菌生理鹽水調(diào)至1×108～2×108mL-1。按照培養(yǎng)基、藥物、菌液的步驟依次加入96孔板中，分別設(shè)置128～0.125 mg·L-1的實(shí)驗(yàn)組，細(xì)菌對(duì)照組和空白對(duì)照組，35 ℃培養(yǎng)16～20 h，實(shí)驗(yàn)質(zhì)控菌為大腸桿菌ATCC 25922。

2 結(jié)果與分析

2.1 LD50測定和新菌株的分離

石斑魚人工感染哈維氏弧菌H11后，癥狀為游動(dòng)緩慢、無力側(cè)臥，體表、魚鰭有潰瘍，下頜充血，死魚解剖后發(fā)現(xiàn)脾臟呈現(xiàn)暗紫色，肝臟腫大充血。最高濃度組石斑魚在感染后第2天開始出現(xiàn)死亡，到第4天全部死亡；最低濃度感染組石斑魚在第2天開始表現(xiàn)出發(fā)病癥狀；注射生理鹽水的對(duì)照組表現(xiàn)正常。石斑魚死亡率統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表1所示。在1∶2的稀釋比例下，石斑魚累計(jì)死亡數(shù)為100%，而高于50%死亡率的最小稀釋比例為1∶8。計(jì)算結(jié)果表明，哈維氏弧菌腹腔注射感染對(duì)石斑魚的LD50為1.2×105g-1魚體重。從感染后的石斑魚中再次分離到一株優(yōu)勢細(xì)菌，其菌落狀態(tài)及生化鑒定結(jié)果為哈維氏弧菌。

表1 注射不同生理鹽水稀釋比例石斑魚的死亡率

對(duì)感染后的石斑魚進(jìn)行致病菌分離鑒定，得到一株優(yōu)勢細(xì)菌，在TCBS培養(yǎng)基上呈現(xiàn)為黃色圓形菌落，表面光滑，中心略凸起，革蘭氏染色陰性，生化鑒定結(jié)果為：VP(-)、明膠液化(+)、木糖(-)、甘露醇(+)、鼠李糖(-)、肌醇(-)、淀粉酶(+)、硝酸鹽還原(+)，結(jié)果與哈維氏弧菌一致。

2.2 噁喹酸在石斑魚體內(nèi)的代謝

分別對(duì)健康組和感染組石斑魚在噁喹酸給藥后各時(shí)間點(diǎn)采集血液樣品，使用高效液相色譜檢測血漿中噁喹酸濃度并擬合藥時(shí)曲線。結(jié)果表明，噁喹酸在健康組和感染組石斑魚血漿中的濃度均呈現(xiàn)先升高后降低的規(guī)律，在健康組中給藥后0.5 h血藥濃度達(dá)到峰值，而在感染組中給藥后1 h達(dá)到峰值，之后均呈下降趨勢。在0.5和24 h健康組的血藥濃度極顯著高于感染組,4、8、12和96 h健康組的血藥濃度也顯著高于感染組，而1、2、48和72 h健康組與感染組血藥濃度組間差異不顯著(圖1)?？傮w而言，健康組的血藥濃度高于感染組的血藥濃度。

圖1 健康組和感染組石斑魚血漿中噁喹酸的藥時(shí)曲線

將健康組和感染組石斑魚血漿中噁喹酸的藥時(shí)數(shù)據(jù)通過藥代動(dòng)力學(xué)軟件winNonln 5.2.1進(jìn)行房室模型擬合，結(jié)果發(fā)現(xiàn),健康組和感染組石斑魚血漿中噁喹酸的藥時(shí)數(shù)據(jù)均符合一級(jí)吸收二室模型，藥動(dòng)學(xué)方程分別為：C=2 739.980e-2.545t+9.039e-0.026t-2 749.019e-0.270t；C=1 297.339e-0.745t+4.058 5e-0.013t-1 301.397e-0.921t。

噁喹酸在血漿中藥動(dòng)學(xué)參數(shù)如表2所示，感染組的達(dá)峰濃度低于健康組，達(dá)峰時(shí)間比健康組延后，血藥濃度時(shí)間線下面積小于健康組但兩組間的差異不明顯，消除半衰期長于健康組。

表2 各組別石斑魚血漿中的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

2.3 哈維氏弧菌對(duì)噁喹酸的敏感性

11株哈維氏弧菌對(duì)噁喹酸的藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,11株哈維氏弧菌對(duì)噁喹酸敏感性存在一定差異，但整體而言其最小抑菌濃度(MIC)值較低。其中，H4菌株的MIC值為0.5 mol·L-1；H2、H3、H5、H10和H11菌株的MIC值為1 mol·L-1；H1、H6、H7、H8和H9菌株的MIC值為2 mol·L-1。

3 小結(jié)與討論

本研究中11株哈維氏弧菌對(duì)噁喹酸的MIC值為0.5～2 mg·L-1，與王元等[12]分析的35株哈維氏弧菌對(duì)噁喹酸的MIC值主要為0.15～2.5 μg·mL-1的結(jié)果相符合。研究表明，噁喹酸對(duì)引發(fā)海水養(yǎng)殖病害的溶藻膠弧菌、哈維氏弧菌、坎貝氏弧菌、副溶血弧菌等弧菌有明顯的抑制效果，對(duì)淡水養(yǎng)殖致病菌嗜水氣單胞菌也具有較明顯的抑制效果[13]。因此，可以考慮將噁喹酸作為防治石斑魚哈維氏弧菌感染的抗菌藥。

抗菌藥物臨床動(dòng)力學(xué)的研究過程中感染模型的建立至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)基于Reed-Muench法分析[8]哈維氏弧菌對(duì)石斑魚的LD50為1.2×105g-1魚體重。陳獻(xiàn)稿等[14]以腹腔注射法分析了哈維氏弧菌對(duì)石斑魚的LD50，其結(jié)果為2.7×106g-1，林克冰[7]等通過肌肉注射、腹腔注射和創(chuàng)傷浸浴3種方式進(jìn)行哈維氏弧菌感染實(shí)驗(yàn)，得到3種方式下哈維氏弧菌對(duì)石斑魚的LD50分別為4.3×104、2.9×105和5.4×106g-1魚體重。以上研究結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果有所不同，可能是由于哈維氏弧菌株、感染劑量和感染方式的不同引起的。本實(shí)驗(yàn)以1.2×105g-1劑量進(jìn)行腹腔注射感染，可以獲得較為典型的感染癥狀，又沒有引起快速死亡，符合人工感染模型的要求。

比較健康組和感染組石斑魚體內(nèi)噁喹酸藥代動(dòng)力學(xué)特征發(fā)現(xiàn)，哈維氏弧菌感染導(dǎo)致血藥達(dá)峰時(shí)間延遲，達(dá)峰濃度降低，消除半衰期變長，血藥濃度時(shí)間線下面積變小。這與劉彥等[15]比較達(dá)氟沙星在健康和鰻弧菌感染牙鲆體內(nèi)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)的結(jié)果一致。哈維氏弧菌感染后血藥濃度時(shí)間線下面積和達(dá)峰濃度比健康組明顯降低，達(dá)峰時(shí)間也有所推遲，這表明哈維氏弧菌感染會(huì)引起機(jī)體對(duì)藥物的吸收能力下降，而消除半衰期變長表明感染會(huì)影響機(jī)體對(duì)藥物的代謝能力。石斑魚感染后藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的改變可能是由于疾病影響了機(jī)體正常的生理、生化機(jī)能和器官功能狀態(tài)，從而使藥物的吸收、分布和代謝等均發(fā)生了變化。因此,在制定臨床給藥方案時(shí)，需要充分考慮疾病因素對(duì)藥物量效關(guān)系的影響。噁喹酸是濃度依賴型的喹諾酮藥物，研究表明Cmax/MIC和AUC0-24/MIC值是評(píng)價(jià)其療效的關(guān)鍵指標(biāo)，當(dāng)AUC24/MIC≥100或Cmax/MIC>8時(shí)可獲得理想的臨床療效[16-17]。在本實(shí)驗(yàn)中，感染條件下血藥達(dá)峰濃度Cmax為11.32 mg·L-1，MIC為1 mg·L-1，Cmax/MIC>8，因此在感染情況下，可以采用20 mg·kg-1的體質(zhì)量給藥方案。