藍(lán)雨， 鄭博文， 魯莎， 李希清， 張軍民

(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院皮膚科，廣東 廣州 510120)

甲真菌病是由皮膚癬菌、酵母菌及非皮膚癬菌等真菌侵犯甲板或甲下所引起的疾病，是皮膚癬菌病中最頑固難治的一種。暴露于相同環(huán)境的個(gè)體對(duì)甲真菌病的敏感性提高,說明可能有甲真菌病的遺傳易感基因的存在，遺傳成分可能會(huì)改變個(gè)體對(duì)真菌感染的敏感性，并且可能影響甲真菌病患者后續(xù)的治療。既往研究表明,甲真菌病的易感性與人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)相關(guān)[1]，HLA基因編碼主要組織相容性復(fù)合物(major histocompatibility complex,MHC)用于呈遞加工后的病原體抗原，并且和免疫應(yīng)答密切相關(guān)[2]，而免疫反應(yīng)的異?？赡軙?huì)導(dǎo)致甲真菌病的遺傳易感性。其中HLA-DR/DQ亞區(qū)在結(jié)構(gòu)上變化最大，因而顯示出明顯的疾病關(guān)聯(lián)性[3]。本研究對(duì)廣東漢族人群甲真菌病患者HLA-DRB1等位基因進(jìn)行檢測(cè)與分析，初步探討HLA-DRB1基因多態(tài)性與甲真菌病的遺傳關(guān)聯(lián)性。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

納入64例來自2019年4月—12月在本院皮膚科門診經(jīng)直接鏡檢和(或)真菌培養(yǎng)確診為甲真菌病者，年齡16～82歲,彼此間無親緣關(guān)系。排除患嚴(yán)重的心、肺、腦、肝、腎等基礎(chǔ)疾病者、患糖尿病者以及正在服用免疫抑制劑或激素者。同時(shí)招募64例本院就診的健康志愿者，其性別、年齡均與患者組相匹配，不伴有其他疾患，既往無甲病病史，否認(rèn)個(gè)人不良嗜好。兩組受試個(gè)體間無血緣關(guān)系，且均為廣東漢族人群。研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批件號(hào):2019-KY-039)。所有入組者均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 全血基因組DNA的提取 抽取樣本外周靜脈血3 mL，置于EDTA抗凝管4 ℃下保存，采用血液基因組DNA提取試劑盒(北京天根生物技術(shù)有限公司)，嚴(yán)格按照說明書要求提取樣本DNA。應(yīng)用N60 Touch超微量分光光度計(jì)(德國IMPLEN公司)檢測(cè),并調(diào)整至DNA濃度>10 ng/μL，OD260/OD280比值1.7～1.9，置于-20 ℃冰箱保存。

1.2.2 HLA-DRB基因等位分型 采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-序列特異性引物(PCR-SSP)法對(duì)128份樣本的DNA進(jìn)行HLA-DRB等位基因分型。按文獻(xiàn)[4]合成序列特異性引物(共14條5′-引物，18條3′-引物，組成23對(duì)引物)及內(nèi)對(duì)照引物(擴(kuò)增HLA-DRB1基因第3內(nèi)含子796 bp片段的保守序列)，所有引物均由上海生工公司合成。加用Taq 聚合酶(日本Takara公司)及DNA樣本后進(jìn)行PCR擴(kuò)增(C1000 Touch PCR儀器，美國BIO-RAD公司)，擴(kuò)增后的產(chǎn)物直接置于DYY-6C型電泳儀(北京市六一儀器廠)進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像(天能1220凝膠成像系統(tǒng))后觀察結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用直接計(jì)數(shù)法進(jìn)行HLA-DRB1等位基因頻率的計(jì)算，等位基因頻率=某基因位點(diǎn)陽性數(shù)/(2×樣本數(shù))。數(shù)據(jù)采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。采用2檢驗(yàn)比較組間HLA-DRB1等位基因頻率，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料

64例甲真菌病患者中，80%以上為腦力工作者，否認(rèn)工作及生活環(huán)境欠佳導(dǎo)致發(fā)生甲真菌病。其中男30例，女34例；年齡16～82歲，平均(45.39±16.54)歲；指甲感染10例(15.62%)，趾甲感染47例(73.44%)，指趾甲感染7例(10.94%)；病程1月～20年，平均(4.57±4.67)年；真菌培養(yǎng)陽性22例，其中紅色毛癬菌10例，須癬毛癬菌6例，念珠菌和鐮刀菌各3例；臨床表現(xiàn)為遠(yuǎn)端側(cè)位甲下型36例(56.25%)，白色淺表型17例(26.56%)，近端側(cè)位甲下型8例(12.50%)，全甲毀損型3例(4.69%)；家屬有感染者13例(20.31%)，其中父母或子女感染9例(14.06%)，夫妻感染4例(6.25%)。

健康對(duì)照組共64例，其中男32例，女32例；年齡20～75歲，平均(42.44±15.16)歲。甲真菌病組與對(duì)照組間、紅色毛癬菌感染的甲真菌病患者組與對(duì)照組間相比，性別(2值分別為0.13、0.35)及平均年齡間(t值分別為1.05、1.08)均無明顯差異(P值均>0.05)。

2.2 甲真菌病患者和健康對(duì)照組HLA-DRB等位基因頻率的比較

甲真菌病患者和健康對(duì)照組HLA-DRB1位點(diǎn)分布分別檢測(cè)出13和12個(gè)等位基因，呈現(xiàn)較高的基因多態(tài)性。其中甲真菌病患者共5例DRB1*10基因陽性，健康對(duì)照組未檢出DRB1*10等位基因，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2=5.10，P<0.05)。詳見表1。

2.3 紅色毛癬菌感染的甲真菌病患者與健康對(duì)照組HLA-DRB等位基因頻率的比較

紅色毛癬菌感染的甲真菌病患者和健康對(duì)照組HLA-DRB位點(diǎn)分布分別檢測(cè)出8和12個(gè)等位基因。紅色毛癬菌感染組未檢出DRB1*01、04、07、12、16等位基因。健康對(duì)照組25例DRB1*12基因陽性，無DRB1*10等位基因陽性。紅色毛癬菌感染組DRB1*12基因頻率明顯低于健康對(duì)照組(2=4.70，P<0.05)，而DRB1*10基因頻率則高于健康對(duì)照組(2=6.44，P<0.05)，進(jìn)一步證明HLA-DRB1*10可能是其易感基因之一。詳見表2。

表1 兩組HLA-DRB1等位基因頻率的比較Tab.1 Comparison of HLA-DRB1 allele frequencies between the two groups

表2 紅色毛癬菌感染的甲真菌病患者和健康對(duì)照組HLA-DRB1等位基因頻率的比較Tab.2 Comparison of HLA-DRB1 allele frequencies between onychomycosis caused by Trichophyton rubrum and the controls

3 討論

甲真菌病是甲病中最常見的一種類型，主要由以紅色毛癬菌為首的皮膚癬菌感染引起。生活方式、基礎(chǔ)疾病以及遺傳基因等各種因素都影響其患病率。由于甲板的構(gòu)造特殊，抗真菌藥無法準(zhǔn)確作用于病灶而起作用，導(dǎo)致甲真菌病治療困難，易于形成一個(gè)潛在的傳染源，被認(rèn)為是一種真菌傳染性疾病，因此關(guān)于基因易感性的遺傳學(xué)研究較少。Zaias等[5]對(duì)12例來自不同國家先證者的家族譜系進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)與甲癬患者結(jié)婚長達(dá)18～60年的伴侶沒有一個(gè)人被感染，反而所有感染甲癬的子女，其父母至少有一方也是甲癬患者，提示了甲真菌病的常染色體顯性遺傳模式。

HLA是目前已知最具有多態(tài)性和最復(fù)雜的遺傳標(biāo)記，與免疫系統(tǒng)疾病、腫瘤、過敏反應(yīng)、微生物感染等疾病相關(guān)[6]。個(gè)人對(duì)感染產(chǎn)生的免疫反應(yīng)很大程度上取決于HLA分子將抗原呈遞給T細(xì)胞和其消除感染細(xì)胞的能力。HLA基因已被證明與麻風(fēng)桿菌[8]和HPV[9]的慢性持續(xù)感染有密切關(guān)系，不僅危害患者的組織器官，還影響患者的心理健康。除細(xì)菌和病毒感染外，既往報(bào)道HLA與球癬菌病(HLA-A9、-B13、-B40)、球孢子菌病(HLA-DRB1*1301)、隱球菌病(HLA-B*5601)、組織胞漿菌病(HLA-B22和-B17)和著色芽生菌病(HLA-A29)均相關(guān)[7]，說明感染性疾病可能通過共同的免疫途徑起作用。因此對(duì)于臨床常見的甲真菌病來說，遺傳學(xué)研究對(duì)于疾病的預(yù)防和探索新的治療方法具有重要的意義。

Zaitz等[10]研究認(rèn)為，HLA-DR53(HLA-DRB4)可能是巴西北歐猶太人紅色毛癬菌導(dǎo)致的甲癬的拮抗基因，而DR52(HLA-DRB3)可能是其易感基因。在墨西哥地區(qū)的臨床研究中發(fā)現(xiàn)HLA-DR6(HLA-DRB1*06)可能是混血墨西哥人紅色毛癬菌感染的甲癬的拮抗基因[7]，而HLA-DR8(HLA-DRB1*08)是其易感基因[11]。我國目前僅有一篇文獻(xiàn)指出HLA-DRB1*14可能系蘇皖籍漢族人群甲須癬毛癬菌感染的易感基因，而HLA-DRB1*15可能是其拮抗基因[12]，暫時(shí)無廣東漢族人群的相關(guān)研究。本研究對(duì)廣東漢族人群的甲真菌病相關(guān)基因進(jìn)行初步探討，發(fā)現(xiàn)甲真菌病患者組和紅色毛癬菌導(dǎo)致的甲癬患者組HLA-DRB1*10基因頻率高于健康對(duì)照組，因此HLA-DRB1*10可能是其易感基因。而紅色毛癬菌導(dǎo)致的甲癬患者HLA-DRB1*12基因頻率低于健康對(duì)照組，HLA-DRB1*12基因可能為紅色毛癬菌導(dǎo)致的甲癬的保護(hù)性基因，該基因的存在可使個(gè)體免于感染紅色毛癬菌導(dǎo)致的甲癬。該結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了HLA等位基因在真菌感染中的地位。但以上各項(xiàng)研究結(jié)果間有差異，原因可能為研究樣本來源于不同地域和種族的人群，以及樣本量的不同、試驗(yàn)方法的差異，導(dǎo)致結(jié)果產(chǎn)生偏移。因此在未來的研究中需要擴(kuò)大樣本量以及增加樣本來源，綜合各個(gè)地區(qū)、民族甲真菌病患者的相關(guān)基因分析，才能更加準(zhǔn)確地反映出HLA-DRB等位基因與甲真菌病的相關(guān)性。

鑒于甲真菌病的頑固難治性和高復(fù)發(fā)率，有效的預(yù)防措施顯得十分重要，首先要積極糾正整體易感因素[13]。盡早篩選出甲真菌病的易感基因，能夠使遺傳易感者提前有效地避免環(huán)境和生活方式等因素的影響，也可以在患病的情況下適當(dāng)延長用藥時(shí)間，或治愈后定期涂抹抗真菌擦劑，以便更有效的防治。在甲真菌病患者長期口服肝毒性抗真菌藥物的情況下，療效的差異也可能是由于基因相關(guān)的藥物遺傳變異所導(dǎo)致。因此易感基因的鑒定對(duì)于藥物遺傳學(xué)也具有重要意義。通過識(shí)別易感基因位點(diǎn)并進(jìn)行相關(guān)功能研究，可為高危個(gè)體的篩查、出現(xiàn)癥狀前患者的早期診斷提供有效手段。

綜上所述，本研究初步探討了廣東漢族人群HLA-DRB1等位基因與甲真菌病的相關(guān)性，結(jié)果顯示HLA-DRB1*10可能是其易感基因，而HLA-DRB1*12基因可能是紅色毛癬菌導(dǎo)致的甲癬的保護(hù)性基因。本研究不僅有助于甲真菌病發(fā)病機(jī)制的研究，而且對(duì)該病早期診斷和治療都有一定的幫助。