魯東平, 張榮, 王芬, 賈婕, 付彪, 陸小蘭

(1.深圳市寶安中醫(yī)院(集團)皮膚科，廣東 深圳 518101；2.深圳市寶安區(qū)慢性病防治院皮膚科，廣東 深圳 518133；3.鄂東醫(yī)療集團黃石市婦幼保健院產(chǎn)科，湖北 黃石 435000；4.鄂東醫(yī)養(yǎng)集團，湖北 黃石 435000)

梅毒治療后會出現(xiàn)非特異性梅毒螺旋體抗體陽性和特異性抗體陽性,或非特異性梅毒螺旋體抗體轉(zhuǎn)陰而特異性抗體陽性兩種情況，這種部分血清學(xué)試驗長期保持陽性的現(xiàn)象，給醫(yī)患帶來一些困惑。目前為止，對梅毒治療后血清學(xué)特點形成的機制尚未完全闡明。Toll 樣受體(Toll-like receptor,TLR)作為天然免疫中的重要識別受體，在感染性疾病的防御中有不可替代的作用，其多態(tài)性可能會影響疾病的發(fā)病、病情以及預(yù)后[1-2]。目前研究較多的是Toll樣受體2(Toll-like receptor 2，TLR2)兩個單核苷酸多態(tài)性位點Arg677Trp和Arg753Gln多態(tài)性與感染性疾病的關(guān)系。已有研究表明TLR2基因多態(tài)性可能與葡萄球菌感染及結(jié)核病相關(guān)[3-4]，是增加感染性疾病易感性的危險因素，但尚未見TLR2基因多態(tài)性與梅毒治療后患者血清學(xué)試驗陽性的相關(guān)報道。本研究采用聚合酶鏈式反應(yīng)-限制性片斷長度多態(tài)性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)分析及DNA測序法，探討TLR2 Arg677Trp和Arg753Gln基因多態(tài)性與此類患者易感性是否相關(guān)，為其形成機制提供理論依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

實驗組1: 2016年1月—2018年1月在我區(qū)已行規(guī)范梅毒治療并確診為梅毒血清固定患者100例。其中男58例，女42例，年齡22～56歲，平均(35.52±5.57)歲。納入標準[5]：①配偶或患者有不潔性交史； ②在確診為血清固定前均已接受過規(guī)范的驅(qū)梅治療，納入研究時無臨床癥狀；③血清學(xué)甲苯胺紅不加熱血清試驗(tolulized red unheated serum test,TRUST)、梅毒螺旋體明膠顆粒凝集試驗(treponema pallidum particle agglutination test，TPPA)檢測均陽性，每3～6個月復(fù)查1次，其中TRUST滴度均≤1 ∶8，在隨訪3年期間滴度無下降或上升4倍的情況；④HIV抗體檢測陰性；⑤無自身免疫性疾病。

實驗組2：梅毒治療后血清學(xué)TPPA持續(xù)陽性3年以上而TRUST陰性的患者50例。其中男32例，女18例；年齡20～54歲，平均(34.24±5.31)歲。納入標準：①配偶或患者有梅毒病史；②已接受過規(guī)范的驅(qū)梅治療，定期隨訪3年或以上；③治療后的一段時間內(nèi)TPPA和TRUST均陽性，2～3年或若干年后TRUST轉(zhuǎn)陰；④HIV抗體檢測陰性。

上述兩組患者均通過病史詢問，長期隨訪。均排除有系統(tǒng)性紅斑狼瘡、傳染性單核細胞增多癥、心肝腎等重大疾病及結(jié)核感染者。

納入健康志愿者100例作為健康對照組，其中男52例，女48例；年齡21～56歲，平均(34.71±5.64)歲。HIV檢測均為陰性。

1.2 試劑及儀器

全血DNA 提取試劑盒(QIAamp DNA Blood Mini Kit，51104)；Taq酶(EasyTaq DNA Polymerase，北京全式金生物，AP101-01)；dNTP(Takara公司，D4030A)；PCR純化試劑盒(QIAquick PCR Purification Kit，28104)；限制性內(nèi)切酶AciI (New England Biolabs，R0157S)。PCR儀(Eppendorf，American)；小型離心機(Eppendorf，American)；紫外分光光度計(Eppendorf，American)；水平凝膠電泳儀(BioRad，American)；凝膠成像分析系統(tǒng)(BioRad, American)。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取和PCR擴增 無菌條件抽取研究對象外周血5 mL，EDTA抗凝，-80 ℃保存。使用全血 DNA提取試劑盒提取DNA，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。PCR反應(yīng)引物由上海生工生物工程有限公司合成(上游引物: 5′-CAGGAAAGCTCCCAGCAGGAA-3′；下游引物:5′- TAGTAAGCAAGTCCTCAAATG-3′)，PCR反應(yīng)體系25 μL: 2.5 μL 10×PCR buffer，1 μL dNTP (2.5 mM), 0.5 μL Taq酶，引物各1 μL，2 μL DNA模板，17 μL雙蒸水。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35 個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.2 RFLP分析及測序 PCR擴增產(chǎn)物使用QIAGEN公司的PCR純化試劑盒純化，操作按說明書進行。RFLP反應(yīng)體系10 μL： PCR產(chǎn)物5.0 μL，限制性內(nèi)切酶AciⅠ 1 μL，10×酶切反應(yīng)buffer 1.0 μL，雙蒸水補至10.0 μL混勻。37 ℃水浴孵育過夜，65 ℃ 加熱20 min停止酶切反應(yīng)。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像分析系統(tǒng)拍照分析并保存實驗結(jié)果。酶切結(jié)果判斷：因引物擴增的590 bp片段包含編碼677和753 位氨基酸的核苷酸序列，野生型片段具有兩個AciⅠ識別位點(CGCC)，當(dāng)677或753氨基酸位點發(fā)生突變時，會失去AciⅠ酶切識別位點，故片段不可以被酶切。在RFLP反應(yīng)結(jié)束后，觀察電泳結(jié)果，如果出現(xiàn)片段長度為135、232和223 bp的PCR條帶，則說明該樣本中677和753位點都未發(fā)生突變；如果片段長度仍然為590 bp，則說明677和753 bp都發(fā)生突變；如果片段長度為135 bp和455 bp，則說明753位點發(fā)生突變；如果片段長度為367 bp和223 bp，則說明677位點發(fā)生突變。對酶切反應(yīng)后電泳結(jié)果不清晰的樣本，于上海生工生物工程有限公司進行 DNA 測序以進一步確認結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，將實驗組1、2和對照組的測序結(jié)果進行比對后，統(tǒng)計三組中突變的位點及突變的頻率后作2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

實驗組1、2和對照組共計250例樣本，RFLP分析結(jié)果顯示，未發(fā)現(xiàn)存在TLR2 Arg677Trp基因多態(tài)性，但實驗組1、2存在753Arg突變。見圖1、圖2。

圖1 TLR2 RFLP酶切示意圖及片段酶切代表圖， 箭頭所指位點為 677及753位AciⅠ酶切位點Fig.1 Diagrams of TLR2 RFLP digestion and fragment digestion. The sites indicated by the arrows are the AciⅠ restriction site at 677 and 753.

圖2 PCR產(chǎn)物酶切結(jié)果Fig.2 Results of PCR product digestion.

使用MEGA軟件,對實驗組1、2以及對照組中TLR2 Arg677Trp和Arg753Gln兩個易突變位點區(qū)測序序列比對后，發(fā)現(xiàn)所有的樣本中677位點均未發(fā)生突變，其DNA序列為CGG；實驗組2中RFLP結(jié)果示部分患者存在753位點突變，其DNA序列為CAG，由于缺失特異性GCGG，導(dǎo)致AciⅠ酶無法識別該位點進行酶切。測序比對見圖3。

綜合RFLP分析及DNA測序鑒定結(jié)果顯示，對照組中無Arg753Gln基因多態(tài)性，實驗組有1例(1%)Arg753Gln基因多態(tài)性，與對照組比較無明顯差異(2=1.01，P=0.316)；實驗組2有6例(12%)出現(xiàn)Arg753Gln基因多態(tài)性，與對照組比較有明顯差異(2=12.50，P<0.01)。

圖3 樣本中代表性TLR2 Arg677Trp和Arg753Gln 基因多態(tài)性測序分析Fig.3 Sequencing analysis of the TLR2 Arg677Trp and Arg753Gln gene polymorphism in the samples.

3 討論

梅毒螺旋體(Treponemapallidum，TP)侵入人體產(chǎn)生兩種抗體，一種是在TP破壞組織時釋放的抗原性物質(zhì)刺激機體產(chǎn)生類脂樣IgM和 IgG抗體 (心磷脂抗體),為非特異性抗體[6]，常用的檢測方法有TRUST、快速血漿反應(yīng)素試驗(rapid plasma reagin test，RPR)等；TP侵入人體還會產(chǎn)生另一種針對TP表面抗原的特異性抗體，檢測方法有TPPA等，用作梅毒確診試驗，通常認為這種特異性抗體在治療后不發(fā)生變化，大多數(shù)患者將終生保持陽性。而TRUST或RPR的滴度在梅毒的病程中會有變化，尤其是早期梅毒治療后滴度通常會下降4倍或以上，隨著時間的延長也可能會陰轉(zhuǎn)，然而有些患者長期保持不變化或變化不足4倍，則稱為血清固定[7]。不同的臨床研究顯示梅毒患者治療后出現(xiàn)的血清固定現(xiàn)象(TRUST和TPPA長期陽性)發(fā)生率在3.80%～56.20%之間[8-10]。另外，在長期隨訪或回顧性研究中，我們經(jīng)常見到TPPA陽性而TRUST或RPR陰轉(zhuǎn)的現(xiàn)象。已有的研究顯示梅毒孕婦人群中TRUST陰轉(zhuǎn)率約為1.81%～3.62%[11]；而Rwmnowski等[12]的結(jié)果顯示RPR陰轉(zhuǎn)率較高，一期梅毒治療3年后 RPR陰轉(zhuǎn)率為72%，二期梅毒RPR陰轉(zhuǎn)率約為56%[12]。除了現(xiàn)有的一些臨床研究外，目前沒有相關(guān)的基礎(chǔ)研究解釋梅毒治療后出現(xiàn)的兩種現(xiàn)象。

TLR2在梅毒免疫機制中有很重要的作用，機體感染TP后，樹突細胞、單核細胞膜上的TLR2可識別TP的脂蛋白[13]，經(jīng)過天然免疫識別信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，啟動獲得性免疫，體內(nèi)將發(fā)生一系列復(fù)雜的細胞免疫和體液免疫，不同患者臨床表現(xiàn)不同、輕重不一，或為顯發(fā)梅毒，或為潛伏梅毒；不同患者對治療的反應(yīng)性不同，血清學(xué)結(jié)果也有不同，具體形成機制不清楚。近來有研究認為梅毒的易感性可能與某些免疫相關(guān)基因存在關(guān)聯(lián)[14-16]。TLR2基因位于人4號染色體上，其基因多態(tài)性會影響TLR2的表達，使TLR2信號傳導(dǎo)受阻，從而改變疾病病程的發(fā)展[17]。已有實驗研究證實 TLR2 Arg677Trp 和Arg753Gln 突變可導(dǎo)致 TLR2 功能障礙[18]，這兩個位點的基因多態(tài)性與萊姆病、麻風(fēng)桿菌感染有密切關(guān)聯(lián)[19-20]。梅毒規(guī)范治療后，患者會出現(xiàn)血清學(xué)試驗陽性的現(xiàn)象，易感基因是否在其中發(fā)揮作用目前尚無相關(guān)研究報道。

本研究采用PCR-RFLP及DNA測序法檢測TLR2 Arg677Trp和Arg753Gln基因多態(tài)性，探討該基因多態(tài)性與梅毒治療后出現(xiàn)血清學(xué)陽性現(xiàn)象的關(guān)系，探索這種現(xiàn)象遺傳易感性。初步研究結(jié)果顯示，在梅毒血清固定、梅毒治療后TPPA陽性TRUST陰性者及健康人中，均未檢測到TLR2 Arg677Trp基因多態(tài)性，說明該位點與梅毒治療后出現(xiàn)血清學(xué)陽性的現(xiàn)象可能無相關(guān)。在梅毒血清固定患者的實驗組中只發(fā)現(xiàn)1例(1%)TLR2 Arg753Gln基因多態(tài)性，與對照組之間比較，差異并無統(tǒng)計學(xué)意義，提示TLR2 Arg753Gln基因多態(tài)性可能在梅毒治療后出現(xiàn)血清固定現(xiàn)象的形成機制中無直接相關(guān)性，說明該現(xiàn)象免疫機制的復(fù)雜性以及與其它疾病的差異性；在梅毒規(guī)范治療后TPPA陽性TRUST陰性者的實驗組中有12%的患者出現(xiàn)TLR2 Arg753Gln基因多態(tài)性，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示該位點基因多態(tài)性與梅毒規(guī)范治療后TPPA陽性TRUST陰性的現(xiàn)象可能相關(guān)。國內(nèi)有學(xué)者對早期梅毒未治療患者的TLR2基因多態(tài)性進行研究，未發(fā)現(xiàn)TLR2 Arg753Gln基因多態(tài)性與梅毒遺傳易感性相關(guān)性[17]，可能與該研究未將梅毒治療后的患者進行分類分析有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)TLR2 Arg677Trp和Arg753Gln基因多態(tài)性與梅毒血清固定無相關(guān)性，與單一TPPA陽性的形成可能相關(guān)，但由于本研究的入組樣本較少，可能會使結(jié)果產(chǎn)生偏倚，該結(jié)果的證實以及基因多態(tài)性與該現(xiàn)象形成關(guān)系的進一步評估，還需擴大樣本量、更嚴格選擇研究對象進行深入的研究。