謝志敏， 潘喬林, 張怡， 沈旭成， 鄧慧妍,, 戴向農(nóng),， 葉興東,

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)皮膚病研究所；2.廣州市皮膚病防治所，廣東 廣州 510095)

天皰瘡(pemphigus)是一種慢性自身免疫性大皰性皮膚病，典型表現(xiàn)為紅斑基礎(chǔ)上松弛性水皰、Nikolsky征陽性、難愈的糜爛伴表面污穢性褐色結(jié)痂，病理特征為表皮內(nèi)水皰且可見棘層松解細胞[1]。依據(jù)臨床和病理表現(xiàn)，天皰瘡分為尋常型、紅斑型、落葉型以及增殖型天皰瘡四種類型，其發(fā)病機制主要是患者存在針對角質(zhì)形成細胞(keratinocyte, KC)橋粒芯糖蛋白(desmoglein，Dsg)的自身抗體IgG結(jié)合到KC誘發(fā)炎癥，導(dǎo)致橋粒破壞和棘層分解，但詳細機制仍然未明。李惠等[2]報道了尋常型和副腫瘤型天皰瘡患者血清使HaCaT細胞Dsg3 mRNA轉(zhuǎn)錄較對照組轉(zhuǎn)錄水平上升1.5～1.8倍。早期研究顯示，基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)9可能參與了PV棘層松解過程[3]，但詳細機制未明。本研究探討PV血清對Dsg1、Dsg3、MMP-9的mRNA轉(zhuǎn)錄及蛋白表達的影響，進一步闡明天皰瘡棘層松解的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗對象

共收集7例PV患者治療前的血清，其中男3例，女4例，年齡32～72歲，平均(36.4±3.9)歲，所有患者均通過臨床和病理診斷為PV并符合如下標準：①皮膚粘膜紅斑基礎(chǔ)上松弛性水皰或大皰；②皮損污穢樣結(jié)痂且糜爛潮濕難以愈合；③皮損或其邊緣正常皮膚Nikolsky征陽性；④皮膚病理檢查表皮內(nèi)水皰，熒光檢查棘層網(wǎng)狀亮綠色熒光IgG沉積。納入標準[4-5]：①符合以上PV診斷標準；②最近30天內(nèi)未使用過免疫抑制劑和糖皮質(zhì)激素；③無其他自身免疫性疾??；④非妊娠期及哺乳期；⑤無重要臟器功能不全。排除標準：①不能除外藥物性天皰瘡者；②合并惡性腫瘤者；③口服過四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類抗菌素者；④不同意參加本研究者。同期收集7例健康體檢志愿者血清作為對照，其中男3例，女4例；年齡30～69歲，平均(38.5±3.6)歲，與PV患者性別(P>0.05)、年齡(t=1.05，P=0.16)相比無明顯差異。本研究及所有相關(guān)實驗均經(jīng)本所倫理委員會審核批準(批件號：201802)。受試者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑

HaCaT細胞由廣州燁善生物科技有限公司提供。實驗試劑：胎牛血清(Hyclone，美國)，DMEM-高糖培養(yǎng)基(Hyclone)，青鏈霉素(Hyclone)，PBS緩沖液(Hyclone);鼠抗人Dsg1抗體、鼠抗人Dsg3抗體、兔抗人MMP-9抗體、兔抗人GAPDH均購自英國Abcam公司，HRP山羊抗小鼠IgG(H+L)、HRP山羊抗小鼠IgG均購自美國Thermo Fisher Scientific公司；細胞核染液DAPI購自廣州凱基生物技術(shù)公司;AK23(一種致病性的抗Dsg3單抗，從天皰瘡小鼠模型中獲取)由日本MBL公司提供。

1.3 實驗方法

1.3.1 HaCaT細胞培養(yǎng) 用干燥管采集患者治療前及對照者靜脈血10 mL，分離血清。為了減少不同PV患者血清成份的差異對細胞實驗的影響，參照既往文獻報道[6]，將7例患者血清混勻用于本研究。HaCaT細胞培養(yǎng)至80%融合時傳代，6孔細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)第三代HaCaT融合至50%～60%時，更換含5%患者血清(簡稱PV血清)的DMEM培養(yǎng)基，以正常培養(yǎng)組(10%胎牛血清)、健康血清組(5%健康血清)為對照，以抗Dsg3單抗作為陽性對照組。放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)18 h后收集細胞進行RNA及蛋白分析。因目前尚無商品化的抗Dsg1抗體，本實驗以抗Dsg3抗體(AK23)作為陽性對照。

1.3.2 實時定量PCR檢測HaCaT細胞Dsg1、Dsg3、MMP-9基因mRNA表達 用PRIMER5軟件/NCBI在線設(shè)計Dsg1基因(NM_ 001942)、Dsg3基因(NM_001944)、MMP-9基因(NM_004994)、GAPDH(NM_001289746)引物，并經(jīng)過序列比對確定引物序列具有良好的特異性。Trizol法提取HaCaT細胞總RNA(設(shè)置3孔實驗，取Ct平均值比較)，A260/280比值1.7～2.0之間，嚴格按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作合成cDNA，然后依據(jù)特異性引物(表1)進行Q-PCR檢測。PCR反應(yīng)體系及參數(shù)：cDNA稀釋10倍后取cDNA 5 μL，上、下游引物各0.5 μL，SYBR?PremixExTaqTM(Tli RNase H Plus，2×)10 μL，ddH2O 4.0 μL，總體積20 μL，用ViiA7擴增儀擴增。反應(yīng)條件95 ℃ 30 s，95 ℃ 3 s，60 ℃ 34 s，40個循環(huán)。

1.3.3 Western Blot檢測Dsg1、Dsg3、MMP-9蛋白表達 6孔板孵育HaCaT細胞，更換各實驗組DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)18 h，收集細胞，通過裂解、離心、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫搖床封閉2 h。與相應(yīng)稀釋的一抗(GAPDH作為內(nèi)參)在4 ℃搖床孵育過夜，TBST洗滌后加入相應(yīng)的二抗室溫搖床孵育1 h。用ECL化學(xué)發(fā)光法在凝膠成像儀(Bio-rad ChemiDocTM XRS)上觀察各自條帶。

1.3.4 HaCaT表達Dsg1、Dsg3的熒光單克隆抗體檢測 將對數(shù)生長期的HaCaT細胞接種于鋪有細胞專用爬片的12孔板中孵育，靜止4 h貼壁于蓋玻片，再更換各實驗組培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)18 h；用PBS清洗，4%多聚甲醛固定30 min。PBS漂洗5 min后吸干，連續(xù)洗3次。接著0.2% Triton-X100 作用 5 min，并以 PBS 清洗后加入 10%山羊血清封閉30 min。加入相應(yīng)一抗4 ℃孵育過夜。加入二抗后室溫孵育1 h。PBS清洗后DAPI室溫濕盒避光孵育5 min，熒光抗淬滅劑封片。倒置光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS CKX41, U-CTR30-2)觀察細胞形態(tài)，倒置熒光顯微鏡(DMI6000B，Leica)下觀察 Dsg3、Dsg1蛋白熒光染色。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

Q-PCR檢測的相對模板量RQ=2-ΔΔCT，ΔΔCt=待測樣品中目的基因平均ΔCt-參照樣品中目的基因ΔCt，ΔCT=目的基因CT-內(nèi)參基因GAPDH平均Ct。數(shù)據(jù)以SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析，不同干預(yù)組間mRNA相對表達量的比較用One-way ANOVA，兩組間的比較采用Bonferroni檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 含5%PV血清的DMEM高糖培養(yǎng)基HaCaT細胞光鏡下形態(tài)變化

鏡下看出，細胞培養(yǎng)18 h后，基本長成致密單層(圖1A)，加入含5% PV血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)18 h，可見老化細胞懸浮，致密單層細胞折光性增強，細胞間聯(lián)結(jié)減弱，細胞游離皺縮、變圓(箭頭處)，胞內(nèi)顆粒變大(圖1B)。

圖1 HaCaT細胞形態(tài)學(xué)變化(100×) 1A：正常培養(yǎng)組18 h后； 1B：加入5%PV血清的DMEM高糖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)18 h后Fig.1 The morphologic changes in HaCaT cells(100×).1A：Cultured under normal condition for 18 hours;1B：After 18-hour culture in DMEM high glucose with 5% PV serum.

2.2 含5%PV血清的DMEM高糖培養(yǎng)基對HaCaT細胞Dsg1、Dsg3和MMP-9 mRNA轉(zhuǎn)錄的影響

通過Q-PCR檢測各組HaCaT細胞在不同干預(yù)條件下Dsg1、Dsg3和MMP-9 mRNA轉(zhuǎn)錄水平,以GADPH為內(nèi)參基因，結(jié)果顯示：PV血清組、抗Dsg3單抗組中Dsg1、Dsg3mRNA相對表達量高于正常培養(yǎng)組及健康血清組。PV血清組MMP-9 mRNA相對表達量高于正常培養(yǎng)組(P=0.014)，但與健康血清組比較無明顯差異(P=0.154)。與正常培養(yǎng)組相比，PV血清組Dsg1、Dsg3、MMP-9相對表達量分別上升約432%、402%、402%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05)；與抗Dsg3單抗組相比，PV血清組Dsg1、Dsg3、MMP-9相對表達量無明顯差異(P值均>0.05)。詳見表2。

表2 不同處理組與HaCaT細胞共培養(yǎng)后Dsg1、Dsg3和MMP-9 mRNA相對表達量Tab.2 Expression levels of mRNA for Dsg1, Dsg3 and MMP-9 in HaCaT cells under different culture

2.3 含5%PV血清的DMEM高糖培養(yǎng)基對HaCaT細胞Dsg1、Dsg3和MMP-9的影響

Western Blot結(jié)果表明：與正常培養(yǎng)組相比，抗Dsg3單抗組、PV血清組HaCaT細胞Dsg1、Dsg3、MMP-9 3種蛋白表達均增加，而健康血清組Dsg1、Dsg3、MMP-9表達量未見明顯差異，見圖2。

2.4 熒光單克隆抗體檢測天皰瘡患者血清對HaCaT細胞表達Dsg1、Dsg3的影響

用間接免疫熒光法檢測各組HaCaT細胞表達Dsg1、Dsg3的影響，用倒置熒光顯微鏡觀察顯示：正常培養(yǎng)組和健康血清組HaCaT細胞形態(tài)完整，結(jié)構(gòu)類似，熒光強度基本相同，細胞膜表面可見中等強度線狀熒光，細胞核染色可見細胞核大，變圓、清晰。Dsg1熒光抗體染色可見PV血清組及抗Dsg3單抗組HaCaT細胞表面線狀熒光消失，轉(zhuǎn)而出現(xiàn)顆粒狀、團塊狀熒光顆粒分散于細胞表面和胞漿區(qū)域，細胞核縮小，細胞間隙增寬；而Dsg3熒光抗體染色可見PV血清組及抗Dsg3單抗組部分HaCaT細胞表面線狀熒光仍然存在，但熒光強度均較正常培養(yǎng)組、健康血清組低，且有細胞核縮小、細胞間隙增寬的現(xiàn)象。PV血清組Dsg1及Dsg3熒光強度較抗Dsg3單抗組低。詳見圖3。

圖2 不同處理組Dsg1、Dsg3、MMP-9、GAPDH 4種蛋白質(zhì)Western Blot圖Fig.2 Expression levels of Dsg1，Dsg3，MMP-9 and GAPDH expression were analyzed by Western Blotting.

圖3 單克隆抗體檢測不同干預(yù)條件下HaCaT表達Dsg1、Dsg-3結(jié)果(40×)Fig.3 Immunofluorescence staining of anti-Dsg1/Dsg3 on the surface of HaCaT cells detected by IIF(40×).

3 討論

PV患者血清中含有Dsg1、Dsg3等多種自身抗體，Dsg“抗體補償學(xué)說”和“空間位阻學(xué)說”是目前公認的PV發(fā)病機制，而“多點攻擊理論”將PV患者表皮棘層松解的機制研究引向深入，且越來越多的證據(jù)支持針對表皮細胞間的多重攻擊導(dǎo)致了表皮松解，參與多重攻擊的因素包括橋粒芯蛋白抗體Dsg1/Dsg3[6]、γδ-T淋巴細胞[5]，以及其他多種非Dsg蛋白如斑菲素蛋白[7]、ATP2C1蛋白[8]、IL-36[9]、線粒體氧化應(yīng)激異常等[10]。Fujimura等[11]研究發(fā)現(xiàn)CD163+組織相關(guān)性巨噬細胞(CD163+tissue associated macrophages, TAMs)在PV皮損中有明顯浸潤，皮損中TAMs相關(guān)的調(diào)節(jié)因子骨膜素蛋白(POSTN)、細胞因子IL-36γ 和MMP-12表達上升，血清中趨化因子CXCL5、可溶性CD163受體水平高于對照組。Schmidt等[12]研究也發(fā)現(xiàn)，KC與PV血清孵育可以導(dǎo)致棘層松解。

李惠等[2]研究發(fā)現(xiàn)，含Dsg3抗體的PV血清可以降低HaCaT細胞表面Dsg3熒光強度，且抗體量達到1 mg/mL時可使Dsg3表達量下降及棘層松解。據(jù)報道，棘層松解存在信號依賴和非信號依賴兩種機制[13]，Dsg3熒光降低的原因包括幾個方面：一是Dsg3自身抗體與抗原位點結(jié)合后阻礙外來抗體的結(jié)合，且Dsg3抗體優(yōu)先與成熟的Dsg3抗原結(jié)合導(dǎo)致Dsg3抗原快速枯竭；二是Dsg3抗體結(jié)合抗原后，p38MAPK激活、網(wǎng)格動力系統(tǒng)誘導(dǎo)的細胞骨架重組共同引起KC細胞Dsg3內(nèi)吞；三是Dsg3抗體結(jié)合后通過MAPK通路導(dǎo)致Dsg裂解和溶解；四是鈣誘導(dǎo)蛋白激酶C介導(dǎo)的KC分化、凋亡過程中MMP-9參與Dsg3降解[14]。因此，Dsg3盡管上調(diào)Dsg3 mRNA，促進Dsg3表達，但增加的Dsg3表達被血清中抗Dsg3抗體及KC細胞對Dsg3內(nèi)吞作用所消耗或抵消。Dsg1、Dsg3單抗這種作用差異是天皰瘡抗原補償機制所不能解釋的，進一步說明了PV發(fā)病機制的復(fù)雜性。

本研究利用含5%PV血清的高糖DMEM培養(yǎng)基孵育HaCaT細胞，探討了PV血清對細胞形態(tài)及表達Dsg、MMP-9的影響。研究顯示，PV血清與HaCaT細胞共培養(yǎng)后，細胞收縮，相鄰細胞融合不連續(xù)，類似棘層松解。研究還顯示PV血清可促進Dsg1、Dsg3、MMP-9表達。Dsg1間接免疫熒光檢測顯示，與正常培養(yǎng)組和健康血清組比較，PV血清組和抗Dsg3單抗組細胞胞漿熒光均呈現(xiàn)為點狀或團塊狀，這種現(xiàn)象可能與Dsg3抗體可以誘使HaCaT Dsg1抗原內(nèi)吞，導(dǎo)致胞漿內(nèi)團塊或者顆粒狀熒光，耗竭細胞表面可結(jié)合的Dsg1從而降低細胞表面Dsg1的熒光強度有關(guān)[15-17]。與Dsg1不同，PV血清組HaCaT表面Dsg3呈線狀表達，細胞漿中未見熒光顆粒，但HaCaT細胞表達Dsg3線狀熒光亮度低于正常培養(yǎng)組和健康血清組，說明Dsg3保留在細胞膜上，但可能因為受到Dsg1的位阻作用，抗體不能和抗原適當(dāng)結(jié)合，導(dǎo)致熒光亮度下降。PV血清組Dsg1及Dsg3熒光強度較抗Dsg3單抗組低，可能與PV血清中同時含有Dsg3及Dsg1抗體有關(guān)。

MMP是一類鋅離子依賴的蛋白酶超家族，參與調(diào)節(jié)細胞基質(zhì)平衡，影響疾病的生理和病理過程[18]。MMP可由角質(zhì)形成細胞、成纖維細胞等多種細胞分泌，分為6類[19]，其中MMP-9屬于明膠酶類，主要降解基底膜Ⅳ型膠原。Cirillo等[20]發(fā)現(xiàn)MMP-9受PV血清調(diào)節(jié)，并與PV棘層松解相關(guān)。PV中被蛋白水解的Dsg1、Dsg3以及其他重要的鈣黏素可能是被某一MMP分開[21]。有報道認為MMP-9參與棘層細胞的凋亡[3]。本研究顯示，PV血清促進MMP-9的轉(zhuǎn)錄及表達，提示MMP-9參與表皮細胞棘層松解。推測PV抗體結(jié)合Dsg抗原后，Dsg蛋白內(nèi)陷，引起橋粒構(gòu)象變化，加上斑菲素蛋白結(jié)合其自身抗體，使橋粒中Dsg相鄰結(jié)構(gòu)松散，觸發(fā)細胞線粒體氧化應(yīng)激，P38MAPK炎癥通路啟動，細胞間橋粒瓦解，細胞皺縮，MMP-9參與角質(zhì)形成細胞凋亡，細胞間橋粒相繼破壞而棘層松解，導(dǎo)致水皰形成。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)PV血清促進HaCaT細胞Dsg1、Dsg3和MMP-9轉(zhuǎn)錄及蛋白的表達，同時可以降低HaCaT細胞表面Dsg1、Dsg3熒光強度。但本研究也存在一些局限，如采集PV患者血清后，沒有純化并檢測其Dsg1、Dsg3滴度，陽性對照組的效應(yīng)相比患者血清也更加明顯，這些現(xiàn)象是否與共孵育患者血清同時含有Dsg1、Dsg3有關(guān)，尚需要進行更深入研究。