(福建省食品藥品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院,福州 350001)

紅豆杉為我國一級(jí)保護(hù)樹種,紅豆杉提取物紫杉醇具有獨(dú)特的抗腫瘤作用機(jī)制[1-3],是臨床應(yīng)用中最為優(yōu)秀的天然抗腫瘤藥物[4-6]。但紅豆杉本身毒性很大,其莖、枝、葉、果、根均含毒性成分,有毒化合物包括紫杉?jí)A、紫杉醇等。在沒有醫(yī)生的指導(dǎo)下,長期大量食用紅豆杉,將引起中毒,主要表現(xiàn)為頭昏、瞳孔放大、惡心、嘔吐、彌散性腹痛、肌無力等癥狀,嚴(yán)重者出現(xiàn)心率過緩、心臟驟?；蛩劳龅萚7-9]?！缎l(wèi)生部關(guān)于進(jìn)一步規(guī)范保健食品原料管理的通知》(衛(wèi)法監(jiān)發(fā)[2002]51號(hào))[10]中,已將紅豆杉列入《保健食品禁用物品名單》,禁止紅豆杉作為保健食品和食品原料使用。2006年衛(wèi)生部發(fā)布第2號(hào)公告[11],嚴(yán)禁食品生產(chǎn)經(jīng)營單位生產(chǎn)和經(jīng)營含紅豆杉的食品。但由于紅豆杉的抗癌特性在民間有較高的知名度,市場上仍存在違法生產(chǎn)銷售以紅豆杉為原料的相關(guān)食品情況[12-13],最常見的是以紅豆杉果為原料,白酒為酒基,制作的所謂紅豆杉酒、紅豆杉保健酒,在一些網(wǎng)絡(luò)銷售平臺(tái)進(jìn)行售賣。

目前我國還未建立任何食品中非法添加紅豆杉的測定方法和標(biāo)準(zhǔn),致使市場監(jiān)管部門在查處相關(guān)案件時(shí)缺乏權(quán)威測定技術(shù)支持。本工作從確定紅豆杉在白酒中的特征成分入手,建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定白酒中紅豆杉特征成分紫杉醇和三尖杉寧堿的方法,并應(yīng)用所建立的方法對(duì)網(wǎng)售紅豆杉酒和市場上其他植物類保健酒、配制酒進(jìn)行測定。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

API 4000Q 型高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀1(用于確定紅豆杉的特征成分);ACQUITY UPLC ICLASS/XEVO TQ-S型高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀2(用于定量分析);Milli-Q IQ 7000型純水系統(tǒng);CR 21N 型高速冷凍離心機(jī)。

紫杉醇和三尖杉寧堿標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:1 000 mg·L－1,分別稱取紫杉醇和三尖杉寧堿對(duì)照品約10 mg,用適量甲醇溶解,并用甲醇定容于10 mL容量瓶中,于4 ℃保存。

紫杉醇對(duì)照品的純度大于98.0%;三尖杉寧堿對(duì)照品的純度為97.0%;甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純;試驗(yàn)用水為純凈水。

1.2 儀器工作條件

1)質(zhì)譜條件(用于確定紅豆杉的特征成分)電噴霧離子源(ESI),正離子模式;離子源溫度450 ℃;全掃描模式,掃描范圍質(zhì)荷比(m/z)為100～500,500～1 000;電噴霧電壓4 500 V;氣簾氣壓力1.72×105Pa,霧化氣壓力3.79×105Pa,輔助氣壓力3.79×105Pa;分辨率2 000。

2)色譜條件(用于定量分析) ACQUITY UPLC R BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm,1.7μm),柱溫30 ℃;流量0.2 mL·min－1;進(jìn)樣量1μL。流動(dòng)相:A 為甲醇,B 為水。梯度洗脫程序:0～1.00 min時(shí),A 為70%;1.00～3.00 min時(shí),A 由70%升至90%,保持1.00 min;4.00～4.01 min時(shí),A 由90%降至70%,保持1.99 min。

3)質(zhì)譜條件(用于定量分析) 電噴霧離子源,正離子模式;離子源溫度150 ℃;毛細(xì)管電壓2.76 k V;脫溶劑氣溫度500 ℃,脫溶劑氣流量950 L·h－1;多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式。其余質(zhì)譜參數(shù)見表1,其中,“?”為定量離子。

表1 質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 MS parameters

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 紅豆杉果酒的制備

紅豆杉采自某鎮(zhèn)紅豆杉林(海拔800 m),摘下果子備用。白酒購于某超市。

將100 g紅豆杉果實(shí)(保持果實(shí)原有形狀)加入300 mL 53°白酒中放置于白酒原包裝瓶中,常溫保存3個(gè)月。

1.3.2 紅豆杉果酒中化學(xué)成分分析

取上述自制的紅豆杉果酒,用蠕動(dòng)泵以流動(dòng)注射方式注入高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀1的質(zhì)譜儀中進(jìn)行掃描。

通過得到的總離子流色譜圖選取可能含有的目標(biāo)成分(紫杉醇和三尖杉寧堿)的母離子,再對(duì)母離子施加一定的碰撞電壓,使其產(chǎn)生特定的子離子,通過分析質(zhì)譜碎片信息,確定含有的特征成分。

1.3.3 特征成分的測定

紅豆杉酒(紅豆杉果酒、紅豆杉樹皮酒)為自制和某網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)購買,其他植物保健酒和植物配制酒來自市場抽檢樣品。

稱取2.00 g紅豆杉酒樣品于100 mL 容量瓶中,用70%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲醇溶液定容,搖勻,以8 000 r·min－1轉(zhuǎn)速離心10 min,取上清液注入高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀2,按儀器工作條件進(jìn)行測定(定量分析)。

2 結(jié)果與討論

2.1 紅豆杉特征成分的選擇

根據(jù)文獻(xiàn)[14-16],從紅豆杉中可分離得到紫杉烷類、黃酮類等化合物,推測白酒浸泡紅豆杉樣品中也可能含有上述物質(zhì)。一些紫杉烷類化合物具有抗癌活性和細(xì)胞毒性[17],作為目標(biāo)物更有利于食品中違法添加行為的執(zhí)法定性,許多紅豆杉分離得到的黃酮類化合物在其他植物提取物中也同樣存在。試驗(yàn)選擇紅豆杉紫杉烷類化合物中含量較多的紫杉醇和三尖杉寧堿作為紅豆杉的特征成分的考察對(duì)象。

根據(jù)網(wǎng)售紅豆杉酒制作方法的前期調(diào)研結(jié)果,模擬紅豆杉酒制作方法自制紅豆杉果酒,將自制紅豆杉果酒直接注入質(zhì)譜儀,分析得到質(zhì)譜碎片信息,紅豆杉果酒中特征成分的分析結(jié)果見表2。

表2 紅豆杉果酒中特征成分的分析結(jié)果Tab.2 Analytical results of characteristic components in Taxus fruit wine

由表2可知:紅豆杉果酒中含有紫杉醇和三尖杉寧堿。試驗(yàn)選擇紫杉醇和三尖杉寧堿作為白酒中紅豆杉的特征成分。

2.2 色譜行為

按儀器工作條件對(duì)紫杉醇和三尖杉寧堿混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定,其多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖見圖1。

按試驗(yàn)方法對(duì)自制的紅豆杉果酒樣品進(jìn)行分析,其多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖見圖2。

2.3 色譜條件的選擇

2.3.1 色譜柱

紫杉醇和三尖杉寧堿極性較弱,在含有弱極性或非極性固定相的反相色譜柱中均有較好的保留。試驗(yàn)考察了紫杉醇和三尖杉寧堿在ZORBAX Elicpse Plus C8Rapid Resolution HD 色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.8μm)和ACQUITY UPLC R BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm,1.7μm)上的保留情況。結(jié)果表明:目標(biāo)物在ACQUITY UPLC R BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm,1.7μm)上出峰峰形較好,無雜質(zhì)干擾,響應(yīng)值較高。試驗(yàn)選用ACQUITY UPLC R BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm,1.7μm)。

圖1 紫杉醇和三尖杉寧堿混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of mixted standard solution of taxol and cephalomannine

圖2 紅豆杉果酒樣品的多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖Fig.2 MRM chromatograms of the sample of Taxus fruit wine

2.3.2 流動(dòng)相

試驗(yàn)分別考察了以甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲酸溶液、乙腈-0.1%甲酸溶液等體系為流動(dòng)相時(shí)紫杉醇和三尖杉寧堿的響應(yīng)情況。結(jié)果表明:上述體系作為流動(dòng)相時(shí),紫杉醇和三尖杉寧堿的峰形都較好,但甲醇-水體系作為流動(dòng)相時(shí),紫杉醇和三尖杉寧堿的響應(yīng)值最高。試驗(yàn)選擇流動(dòng)相為甲醇-水體系。

2.4 質(zhì)譜條件的選擇

將50.0μg·L－1紫杉醇和三尖杉寧堿混合標(biāo)準(zhǔn)溶液以針泵進(jìn)樣方式注入高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀2,在正離子模式下進(jìn)行全掃描,紫杉醇及三尖杉寧堿形成母離子峰,m/z分別為876.1,854.1。然后施加一定的碰撞電壓進(jìn)行子離子掃描,選取信號(hào)最強(qiáng)的2個(gè)子離子分別作為定性和定量離子,優(yōu)化碎裂電壓和碰撞電壓,試驗(yàn)選擇的碎裂電壓和碰撞電壓見表1。

分析紫杉醇和三尖杉寧堿這2種特征成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)和母離子、子離子質(zhì)荷比,可知其裂解規(guī)律如下:紫杉醇和三尖杉寧堿均由一個(gè)相同的C6－C8－C6環(huán)結(jié)構(gòu)和一個(gè)不同的側(cè)鏈基團(tuán)組成。紫杉醇及三尖杉寧堿均可形成穩(wěn)定的[M＋Na]＋峰,m/z分別為876.1(紫杉醇加鈉峰),854.1(三尖杉寧堿加鈉峰)。碰撞后,以T 代表C6－C8－C6環(huán)結(jié)構(gòu),SCH代表各自的側(cè)鏈基團(tuán)。紫杉醇m/z為308.0的子離子為[M－T＋Na]＋,m/z為531.0 的子離子為[M－SCH－CH3COOH＋Na]＋;三尖杉寧堿m/z為286.0的子離子為[M－T＋Na]＋,m/z為531.0的子離子為[M－SCH－CH3COOH＋Na]＋。試驗(yàn)選擇的質(zhì)譜條件見1.2節(jié)。

2.5 前處理?xiàng)l件的選擇

2.5.1 凈化方法

使用空白白酒樣品配制200.0μg·L－1的紫杉醇和三尖杉寧堿混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,考察了C18柱凈化、石墨化炭黑柱凈化、Qu ECh ERS法(N-丙基乙二胺和炭黑吸附劑)凈化以及50倍直接稀釋法進(jìn)樣等4種凈化方法對(duì)紫杉醇和三尖杉寧堿回收率的影響,平行測定6次,結(jié)果見表3。

表3 凈化方法對(duì)紫杉醇和三尖杉寧堿回收率的影響Tab.3 Effect of purification method on recovery of taxol and cephalomannine%

試驗(yàn)結(jié)果表明:C18柱凈化時(shí)流量較慢,耗時(shí)較長;QuEChERS法凈化時(shí),紫杉醇和三尖杉寧堿的回收率偏低,重復(fù)性較差;直接稀釋法進(jìn)樣和石墨化炭黑柱凈化時(shí),紫杉醇和三尖杉寧堿的回收率均較好。為了盡量簡化試驗(yàn)步驟,試驗(yàn)選用直接稀釋法進(jìn)樣。

2.5.2 樣品稀釋溶劑

試驗(yàn)分別考察了樣品稀釋溶劑依次為水、30%甲醇溶液、40%甲醇溶液、50%甲醇溶液、60%甲醇溶液、70%甲醇溶液、80%甲醇溶液和甲醇時(shí)對(duì)紫杉醇和三尖杉寧堿測定的影響。結(jié)果表明:樣品稀釋溶劑為70%甲醇溶液時(shí),紫杉醇和三尖杉寧堿的響應(yīng)值最高。試驗(yàn)選擇樣品稀釋溶劑為70%甲醇溶液。

2.5.3 過濾方法

試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn):采用0.22μm 有機(jī)濾膜(材質(zhì)為尼龍66)過濾時(shí),紫杉醇和三尖杉寧堿會(huì)被濾膜吸附,紫杉醇損失較大,三尖杉寧堿也有少量損失。因此,樣品溶液上機(jī)前不過濾膜,采用離心方式沉淀雜質(zhì),減少干擾的同時(shí)可以避免過濾造成的紫杉醇和三尖杉寧堿的損失。

2.6 基質(zhì)效應(yīng)

測定對(duì)象的基質(zhì)通常會(huì)對(duì)目標(biāo)成分的分析過程產(chǎn)生干擾,影響分析結(jié)果準(zhǔn)確性[18-19]。在實(shí)際應(yīng)用過程中,色譜-質(zhì)譜法的準(zhǔn)確度、精密度很容易受到基質(zhì)干擾[20],紅豆杉和白酒的成分復(fù)雜,因此需要評(píng)價(jià)所建立的測定方法中基質(zhì)效應(yīng)帶來的影響[21]。

采用空白白酒配制基質(zhì)匹配的紫杉醇和三尖杉寧堿混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(0,50.0,100.0,200.0,500.0μg·L－1),同時(shí)用樣品稀釋溶劑配制5個(gè)相同質(zhì)量濃度的紫杉醇和三尖杉寧堿混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,以基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率之比與100%的差來考察化合物的基質(zhì)效應(yīng)[22-23]。結(jié)果表明:紅豆杉酒中紫杉醇和三尖杉寧堿的基質(zhì)抑制率分別為－9.5%和－6.8%,基質(zhì)效應(yīng)表現(xiàn)為弱抑制效應(yīng)[24]。因此,本方法可以不考慮基質(zhì)效應(yīng)對(duì)定量的影響。

2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和測定下限

移取適量的1 000 mg·L－1紫杉醇和三尖杉寧堿標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液用70%甲醇溶液逐級(jí)稀釋混合成低含量和高含量兩種含量梯度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。低含量的紫杉醇和三尖杉寧堿混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列均含0,0.050,0.100,0.200,0.500,1.00μg·L－1的紫杉醇和三尖杉寧堿。高含量的紫杉醇和三尖杉寧堿混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列含0,20.0,50.0,100.0,200.0,500.0μg·L－1的紫杉醇,0,5.00,10.0,20.0,50.0,100.0,200.0μg·L－1的三尖杉寧堿。

按儀器工作條件對(duì)低含量和高含量的紫杉醇和三尖杉寧堿混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進(jìn)行測定,并以紫杉醇和三尖杉寧堿的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。紫杉醇與三尖杉寧堿的線性范圍、線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表4。

表4 線性范圍、線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)Tab.4 Linearity ranges,linear regression equations and correlation coefficients

以3 倍信噪比計(jì)算方法的檢出限(3S/N),以10倍信噪比計(jì)算方法的測定下限(10S/N),得到紫杉醇與三尖杉寧堿的檢出限均為2.5μg·kg－1,測定下限均為8.3μg·kg－1,遠(yuǎn)小于市場上紅豆杉酒實(shí)際樣品測定值,靈敏度完全可滿足實(shí)際測定的需要。紫杉醇和三尖杉寧堿的實(shí)際樣品測定值與方法檢出限相差數(shù)百至數(shù)千倍,故低含量和高含量的兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線,可分別適用于空白樣品和陽性樣品的分析,可避免標(biāo)準(zhǔn)曲線含量范圍跨越過多數(shù)量級(jí),造成線性擬合失真。

2.8 精密度和回收試驗(yàn)

按試驗(yàn)方法對(duì)空白白酒樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn),計(jì)算回收率和測定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見表5。

表5 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)Tab.5 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

由表5可知:回收率為96.4%～116%,RSD 為1.1%～2.6%。本方法的準(zhǔn)確度和精密度滿足GB/T 27404－2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測》的要求。

2.9 樣品分析

按試驗(yàn)方法對(duì)10批網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)購買的紅豆杉酒(紅豆杉果酒、紅豆杉樹皮酒)進(jìn)行分析,結(jié)果見表6。

表6 樣品分析結(jié)果Tab.6 Analytical results of the samples mg·kg－1

由表6可知:10份樣品均檢出紅豆杉特征成分紫杉醇和三尖杉寧堿,紅豆杉樹皮酒中紫杉醇和三尖杉寧堿的含量比紅豆杉果酒中紫杉醇和三尖杉寧堿的含量高。本方法適用于紅豆杉果酒和紅豆杉樹皮酒的識(shí)別。

按試驗(yàn)方法對(duì)市場上常見的植物類保健酒樣品和配制酒樣品進(jìn)行分析,以驗(yàn)證方法的特異性。試驗(yàn)分析了3批次枸杞酒、1批次桂圓枸杞酒、2批次參酒、1批次八珍酒、2批次露酒等9批保健酒,1批次純谷酒、1批次苦蕎酒共2批次配制酒,這些酒的原料涉及枸杞、桂圓、人參、黃芪、五加皮、肉桂、天麻、杜仲、黃精、木瓜、黑桑椹、葛根、山楂、沙棘等中藥材或植物。結(jié)果表明:11批樣品均未檢出紫杉醇和三尖杉寧堿,說明其他植物類酒并未含有紫杉醇和三尖杉寧堿,本方法特征成分的選取和測定具有特異性。

本工作建立了測定白酒中紅豆杉特征成分紫杉醇和三尖杉寧堿含量的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法,方法步驟簡便、快速,方法學(xué)指標(biāo)符合食品理化檢測質(zhì)量控制規(guī)范。通過本方法分析網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)購買的紅豆杉酒樣品,全部樣品均檢出紫杉醇和三尖杉寧堿,而對(duì)其他若干種中藥材保健酒樣品的分析均未檢出紫杉醇和三尖杉寧堿。這表明網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)售賣的所謂紅豆杉酒存在較大食品安全風(fēng)險(xiǎn)。本方法可應(yīng)用于酒中紅豆杉特征成分含量的測定,為市場監(jiān)管部門對(duì)酒中非法添加紅豆杉違法行為的執(zhí)法稽查提供了技術(shù)支持,為進(jìn)一步制定食品中非法添加紅豆杉補(bǔ)充檢驗(yàn)方法和國家檢測標(biāo)準(zhǔn)提供了技術(shù)基礎(chǔ)。另外,可通過本方法對(duì)市場上出現(xiàn)的可疑紅豆杉酒開展監(jiān)測和分析,為市場監(jiān)管部門制定食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測計(jì)劃提供依據(jù),有利于遏制紅豆杉被誤用、濫用或違規(guī)使用的勢頭。