沈茹 蔣鴻超 吳建敏 楊曉紅 張林 段麗芬 李海波

常染色體顯性智力障礙9 型（Autosomal dominant mental disorder type 9，MRD9）是一種常染色體顯性遺傳病，目前報(bào)道的文獻(xiàn)非常少，它是由于染色體2q37 肌動(dòng)蛋白家族1A（Kinesin family member 1A，KIF1A）基因突變引起的智力障礙（OMIM：614255）［1］。KIF1A基因突變可以導(dǎo)致常染色體顯性遺傳痙攣性截癱［2-3］，遺傳性感覺(jué)和自主神經(jīng)病變2 型（HSAN2）（OMIM：614213），可導(dǎo)致自閉癥和多動(dòng)癥并伴有感覺(jué)障礙和痙攣性截癱［4］，也可導(dǎo)致非綜合征和綜合征性智力障礙（MRD9）［5］。MRD9 的智力障礙和步態(tài)不穩(wěn)是進(jìn)行性的，發(fā)生在嬰兒期早期，嚴(yán)重程度不一［6］。如果能夠早期確診后對(duì)患兒的生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)行干預(yù)和對(duì)癥處理，對(duì)腳部畸形的矯正和后期患兒的康復(fù)起到至關(guān)重要的作用。目前雖然已經(jīng)有報(bào)道KIF1A基因突變能夠?qū)е翸RD9。也有研究證實(shí)KIF1A基因突變導(dǎo)致常染色體顯性遺傳，如KIF1A運(yùn)動(dòng)域的新發(fā)突變（p.S69L）主要由痙攣性截癱形式的父親遺傳給兒子［7］，另一個(gè)文獻(xiàn)同樣報(bào)道KIF1A雜合變異體在一個(gè)HSP 顯性分離模式的家族中被發(fā)現(xiàn)［8］，這些病例的主要表型也有發(fā)育遲緩和/或伴有小腦、大腦和/或視神經(jīng)萎縮。目前KIF1A基因突變導(dǎo)致MRD9 的發(fā)病機(jī)制尚不明確，鑒別診斷非常困難，本次研究采用全外顯子測(cè)序發(fā)現(xiàn)了KIF1A基因新的致病位點(diǎn)，擴(kuò)展了MRD9 基因型與臨床表型譜。

1 材料與方法

1.1 患者資料

患兒2019年6月到本院門(mén)診就診，患兒主訴是自幼行走不穩(wěn)，步態(tài)異常易跌倒，語(yǔ)言表達(dá)差，外斜視；門(mén)診擬診雙下肢行走不穩(wěn)待查，精神運(yùn)動(dòng)語(yǔ)言發(fā)育遲滯收入本院病房。

入院后對(duì)患兒進(jìn)行全面檢查?；純?，女孩，G3P2，2014年10月在云南省墨江縣醫(yī)院出生。其母親產(chǎn)前檢查一切正常，在孕41 周順產(chǎn)?；純撼錾w重3.2 kg，出生時(shí)無(wú)窒息，Apgar 評(píng)分10 分，喂養(yǎng)正常。生長(zhǎng)發(fā)育史：8 個(gè)月開(kāi)始爬；20月會(huì)站立；24 個(gè)月開(kāi)始走，走路不穩(wěn)，經(jīng)常摔倒，早上較重；12 個(gè)月始出牙；12 個(gè)月始說(shuō)話，但是至今已4 歲7個(gè)月只會(huì)說(shuō)爸爸、媽媽簡(jiǎn)單兩三個(gè)字的詞語(yǔ)。父母無(wú)親緣關(guān)系；家族遺傳史：患兒爺爺、兩個(gè)伯父和父親均為耳聾；患兒姐姐2010年出生，目光呆滯，反應(yīng)遲鈍，智力語(yǔ)言明顯落后。目前患兒身高90 cm，體重14 kg，大小便可自理；咽反射基本正常；聽(tīng)力正常。眼科檢查：看人時(shí)雙眼角膜向上，外斜視，無(wú)視神經(jīng)萎縮跡象。神經(jīng)系統(tǒng)檢查：步態(tài)異常，行走不穩(wěn)，共濟(jì)運(yùn)動(dòng)檢查：指鼻試驗(yàn)（-），跟膝脛試驗(yàn)（-），Romberg 試驗(yàn)（+）。雙側(cè)足內(nèi)翻，沒(méi)有足下垂；四肢肌力正常，下肢肌張力正常，腹壁反射（+），膝反射（+），雙側(cè)自發(fā)巴氏征（+），頸無(wú)抵抗，布氏征（-），克氏征（-）。見(jiàn)圖1。

1.2 診療經(jīng)過(guò)

1.2.1 臨床檢查

患兒入院后除了進(jìn)行肝腎功、心肌酶和電解質(zhì)等常規(guī)檢查外，還進(jìn)行血糖、血氨、骨化二醇、銅藍(lán)蛋白、微量元素，鐵蛋白，血脂、腎功能、甲狀腺功能等代謝相關(guān)檢查；同時(shí)進(jìn)行了顱腦及肢體的影象學(xué)檢查；以及心臟超聲和心電圖檢查。采集患兒的足跟血干血斑進(jìn)行新生兒遺傳代謝病串聯(lián)質(zhì)譜，及尿液的氣相質(zhì)譜檢測(cè)。

1.2.2 全外顯子組基因測(cè)序

本研究通過(guò)了昆明醫(yī)科大學(xué)附屬昆明市兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)，征得患兒父母遺傳分析的知情同意。采集病人及其父母、姐姐和弟弟的外周血進(jìn)行家系（Trios）測(cè)序和全外顯子組+拷貝數(shù)變異（CNV）檢測(cè)。

首先進(jìn)行先證者及其家系的外周血提取基因組DNA，經(jīng)片段化、連接接頭、擴(kuò)增純化后，使用雜交捕獲方法制備DNA 文庫(kù)，然后采用高通量測(cè)序平臺(tái)（Illumina Novaseq6000，USA）檢測(cè)人類全外顯子組中20 099 個(gè)基因的外顯子區(qū)域及旁側(cè)內(nèi)含子區(qū)域（20 bp）。將測(cè)序數(shù)據(jù)與人類基因組hg19（GRCh37）參考序列進(jìn)行比對(duì)，并對(duì)目標(biāo)區(qū)域的覆蓋度和測(cè)序質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估。通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)多重檢索，獲取與受檢者表型相關(guān)的1 523 個(gè)基因。參照2015年版美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)（ACMG）指南對(duì)變異進(jìn)行致病性評(píng)估。本檢測(cè)分析了所列基因的大片段（連續(xù)2 個(gè)及以上外顯子）CNV，報(bào)告的CNV 均經(jīng)正交試驗(yàn)驗(yàn)證（qPCR或MLPA）。當(dāng)檢出的致病或可能致病變異存在于常染色體隱性基因中時(shí)，實(shí)驗(yàn)室通過(guò)NGS 和/或Sanger 測(cè)序確保該基因編碼序列的覆蓋率達(dá)到100%。

1.2.3 測(cè)序數(shù)據(jù)分析及Sanger 測(cè)序驗(yàn)證

公共數(shù)據(jù)庫(kù)（ESP6500，1000genomes，ExAC，GnomAD）用于過(guò)濾頻率高于0.001 的變異。使用四種軟件（PolyPhen-2、SIFT、CADD 和Mutation Taster）預(yù)測(cè)單核苷酸變異（single nucleotide variants，SNV）的致病性。測(cè)序后根據(jù)ACMG 指南致病性評(píng)估結(jié)合患兒臨床資料分別進(jìn)行遺傳學(xué)分析。隨后根據(jù)WES 中發(fā)現(xiàn)的突變分別設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增以進(jìn)行Sanger 測(cè)序，驗(yàn)證WES 的結(jié)果及遺傳模式。測(cè)序結(jié)果通過(guò)Mutation Surveyor軟件進(jìn)行序列比對(duì)分析，并進(jìn)行家系驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 臨床結(jié)果

2.1.1 常規(guī)檢查結(jié)果患兒血液、尿液的串聯(lián)質(zhì)譜檢查顯示結(jié)果無(wú)異常，排除患兒有遺傳代謝性疾病。

2.1.2 影像檢查結(jié)果

影像學(xué)檢查：顱腦+頸椎+腰骶椎MRI 平掃顯示雙側(cè)小腦半球體積減小，腦溝加深、增寬；第四腦室稍擴(kuò)大。螺旋CT 顱腦平掃未見(jiàn)異常；周圍神經(jīng)傳導(dǎo)功能：周圍神經(jīng)運(yùn)動(dòng)傳導(dǎo)功能異常（左側(cè)CMAP 波幅稍低）。常規(guī)心臟彩超檢查未見(jiàn)異常。十二通道心電圖檢查為竇性心律，正常心電圖。胸部正側(cè)位片示雙肺紋理增多，心隔未見(jiàn)明顯異常。見(jiàn)圖2。

2.2 全外顯子組基因測(cè)序

測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)一個(gè)與患兒臨床表型高度相關(guān)的基因KIF1A：c.914C＞T（p.Pro305Leu）（NM_004321.7）雜合錯(cuò)義突變位點(diǎn)。此突變位點(diǎn)在KIF1A基因11 號(hào)外顯子區(qū)域，出現(xiàn)的雜合突變c.914C＞T 使編碼區(qū)第914 位堿基的胞嘧啶（C）變?yōu)樾叵汆奏ぃ═），該變異導(dǎo)致編碼蛋白的第305 位氨基酸的脯氨酸（Pro）變成亮氨酸（Leu）。

2.3 Sanger 測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果

Sanger 測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果顯示此患兒攜帶KIF1A：c.914C＞T（p.Pro305Leu）雜合突變，其父母均未攜帶，其姐姐及弟弟此位點(diǎn)均無(wú)突變，因此，該變異位點(diǎn)為新生變異。見(jiàn)圖3。

3 討論

基因突變位點(diǎn)KIF1A：c.914C＞T（p.Pro305Leu）（NM_004321.7）在一般人群數(shù)據(jù)庫(kù)gnomAD 中未收錄，該變異尚未在HGMD 數(shù)據(jù)庫(kù)收錄，為新發(fā)現(xiàn)的變異位點(diǎn)。通過(guò)Grantham's Distance 軟件預(yù)測(cè)提示脯氨酸和亮氨酸的理化性質(zhì)差異中等（Grantham dist：98）［6-7］。氨基酸保守性分析表明，該位點(diǎn)的野生型氨基酸（Pro305）在分析的90 種脊椎動(dòng)物中保守，表明該位點(diǎn)發(fā)生變異很大的可能將不被容忍，并可能對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和/或功能產(chǎn)生不良影響。該錯(cuò)義突變?cè)? 種功能預(yù)測(cè)軟件中都提示有害（SIFT Score：0.001，Polyphen2 HVAR Score：0.999，Mutation Taster Score：1.1），根據(jù)ACMG 指南，該變異評(píng)級(jí)為疑似致病突變，根據(jù)患兒的臨床表現(xiàn)和基因分析結(jié)果，此患兒診斷為MRD9。

KIF1A基因新生突變致病有報(bào)道稱表型特征為中度至重度發(fā)育遲緩或智力落后，多數(shù)表現(xiàn)為小腦萎縮、視神經(jīng)萎縮、軸索感覺(jué)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)病和痙攣性麻痹［6］。本例患者突變與MDR9 已經(jīng)報(bào)道過(guò)的表型有相同的特征；MRI 顯示雙側(cè)小腦半球體積減小，腦溝加深、增寬，說(shuō)明有小腦萎縮。步態(tài)異常和行走不穩(wěn)的表型特征在MRD9 的OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)中均有描述，值得注意的是患者還存在雙側(cè)足內(nèi)翻和自發(fā)巴氏征陽(yáng)性，右足尤其明顯。本次病例出現(xiàn)的足內(nèi)翻、自發(fā)巴氏征陽(yáng)性、看人時(shí)角膜向上和外斜視都是MRD9 首次報(bào)道的表型。

KIF1A基因編碼特定于神經(jīng)元的運(yùn)動(dòng)蛋白［9］，最早是在研究神經(jīng)軸突的膜泡運(yùn)輸時(shí)發(fā)現(xiàn)的，KIF1A主要負(fù)責(zé)神經(jīng)系統(tǒng)里軸突上突觸囊泡前體的快速運(yùn)輸，并且它介導(dǎo)的軸突運(yùn)輸對(duì)神經(jīng)的成長(zhǎng)、存活和功能發(fā)揮有重要的作用［10-12］。疾病相關(guān)突變使突觸囊泡前體的KIF1A 運(yùn)動(dòng)和軸突順行轉(zhuǎn)運(yùn)亢進(jìn)，導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元受損［13］，因此走路不穩(wěn)易摔倒、語(yǔ)言發(fā)育遲緩和智力落后為其主要臨床癥狀。本例患兒的原因可能與KIF1A基因突變使運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元受損相關(guān)。

盡管KIF1A基因突變已經(jīng)在一些神經(jīng)退行性疾病的家族中被描述過(guò)，但是兒童患病報(bào)道很少，對(duì)于KIF1A基因?qū)е翸RD9 的表型程度和致病機(jī)制的研究知之甚少。Hamdan et al 2011年報(bào)道的一個(gè)新生錯(cuò)義突變（p.T99M）影響了發(fā)育遲緩和小腦萎縮兒童的KIF1A 結(jié)構(gòu)域的ATP 結(jié)合位點(diǎn)［14］。為了確定Thr99Met 錯(cuò)義突變是否影響KIF1A沿神經(jīng)突的運(yùn)動(dòng)，曾經(jīng)有研究者們使用不同的KIF1AMD-EGFP 融合構(gòu)建轉(zhuǎn)染了大鼠初級(jí)海馬神經(jīng)元，該突變被證明會(huì)影響KIF1A的運(yùn)動(dòng)活性［15］。因此，我們這例患兒發(fā)病的確切機(jī)制需要進(jìn)一步的功能研究來(lái)充分闡明KIF1A變異的遺傳優(yōu)勢(shì)和神經(jīng)元類型特異性。

本次研究患兒有家族遺傳史，爺爺、爸爸和叔叔均為不同程度的耳聾。本研究結(jié)果說(shuō)明MYT1L基因exon 15 堿基缺失發(fā)生6 個(gè)移碼突變后使翻譯停止導(dǎo)致的常染色體顯性精神發(fā)育遲滯39 型。因此，本研究也證實(shí)患兒與姐姐雖然都有先天性智力落后和發(fā)育遲緩缺陷，但是WES 顯示她們的致病基因明顯不同，所患疾病也不同。這也提示一個(gè)遺傳病家族成員中，可能同時(shí)存在多個(gè)遺傳學(xué)病因。