陳杏園 羅世強(qiáng) 王秋華 袁德健 許澤輝 王敬仁 覃柳群 唐寧★

自然流產(chǎn)是指妊娠在28 周前自行終止，胎兒體重＜1 000 g 者，是健康育齡期婦女常見的妊娠并發(fā)癥，約占臨床妊娠的10%～15%［1］。造成胚胎停育的原因有很多，遺傳因素在早孕期自然流產(chǎn)病因中占很大比例，有報(bào)道早期自然流產(chǎn)絨毛染色體異常率可達(dá)75%［2］，包括非整倍體、多倍體、部分缺失或部分重復(fù)等［3］。隨之而來的生殖風(fēng)險(xiǎn)取決于重排類型及其親本來源［4］。目前用于檢測染色體畸變的方法多種多樣，與常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)分析相比，多重連接依賴式探針擴(kuò)增技術(shù)（multiple ligation-dependent probe amplification，MLPA）技術(shù)成本相對較低、勞動(dòng)力密集度較低、并且等待時(shí)間較短、準(zhǔn)確度較高，因此，MLPA 可以作為早期自然流產(chǎn)遺傳學(xué)檢測的首選方法［5］。本研究用MLPA 技術(shù)檢測自然流產(chǎn)胚胎染色體異常，分析早期自然流產(chǎn)胚胎染色體異常情況并進(jìn)一步分析其相關(guān)的影響因素，為進(jìn)一步遺傳咨詢提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 對象

收集2016年3月到2017年12月在柳州市婦幼保健院就診的稽留流產(chǎn)孕婦患者774 例，患者具有停經(jīng)史、血尿檢查HCG 陽性；超聲檢查見空孕囊或?qū)m腔內(nèi)見胚芽或胚胎樣組織，經(jīng)檢測無胎心；自愿接受流產(chǎn)絨毛組織染色體非整倍體檢測。孕婦年齡19～44 歲，平均年齡31.7±5.9 歲，孕周為5周0 天～15 周3 天。

1.2 方法

1.2.1 流產(chǎn)絨毛組織基因組DNA 提取

鏡下挑選5～10 mg 絨毛組織剪碎，常規(guī)酚-氯仿法提取基因組DNA。采用ASP-2680 核酸分析儀檢測DNA 濃度純度，A260/A280 在1.6～1.9 之間，濃度為）20～30 ng/μL。

1.2.2 MLPA 檢測

采用P036 和P070 探針試劑盒（荷蘭，MRCHonand 公司），23 對染色體中除13、14、15 染色體長臂2 個(gè)探針，Y 染色體長臂1 個(gè)探針外，其它染色體長、短臂末端各有2 個(gè)檢測探針。提取DNA后經(jīng)過變性、雜交、連接及PCR 反應(yīng)后，取PCR產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測，并對檢測數(shù)據(jù)運(yùn)用Coffalyser 專用軟件（荷蘭MRC 公司）分析。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，檢出率用百分率（%）表示，組間資料采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MLPA 檢測結(jié)果

收集774 例樣本，檢測成功98.97%（766/774），8 例因標(biāo)本腐敗提取的DNA 濃度和純度無法滿足實(shí)驗(yàn)要求。MLPA 檢測發(fā)現(xiàn)染色體異常52.09%（399/774）。其中，染色體非整倍體畸變占50.26%，以47，XN，+16 比例最高，其次為47，XN，+22 和45，XO，同時(shí)檢測出染色體單體，染色體雙三體，嵌合體，和其它復(fù)雜染色體非整倍體畸變等，在復(fù)合型染色體畸變中也是涉及16、22 和X染色體的較多見；染色體部分缺失或重復(fù)占1.31%。見表1。

2.2 不同年齡段組流產(chǎn)胚胎染色體情況

孕婦在小于20 歲和大于35 歲年齡段其流產(chǎn)胚胎中染色體異常檢出率明顯較高（P＜0.05），在≥35 歲流產(chǎn)孕婦的胚胎中，染色體異常檢出率高達(dá)66.53%。多條染色體非整倍體畸變，及大部分小染色體非整倍體畸變的流產(chǎn)胚胎多見于年齡≥35歲高齡孕婦，而涉及性染色體異常流產(chǎn)胚胎則多見于年齡＜35 歲孕婦。見表2。

2.3 不同孕周組流產(chǎn)胚胎染色體情況

不同孕周各組流產(chǎn)胚胎染色體異常情況見表3，孕周＜12 周流產(chǎn)人群中染色體異常檢出率明顯高于≥12 周的染色體異常檢出率（P＜0.05），＜12 周流產(chǎn)人群的發(fā)生率高于≥12 周流產(chǎn)人群（P＜0.05）。見表3。

表1 流產(chǎn)胚胎MLPA 檢測結(jié)果分析［n（%）］Table 1 Analysis of MLPA test results of aborted embryos［n（%）］

表2 不同年齡段組流產(chǎn)胚胎染色體情況Table 2 Chromosomes of aborted embryos in different age groups

表3 不同孕周組流產(chǎn)胚胎染色體情況Table 3 Chromosomes of aborted embryos in different gestational weeks

3 討論

自然流產(chǎn)是婦產(chǎn)科常見病癥之一，流行病學(xué)上最常見的原因是胎兒染色體異常［6］，可能與孕婦年齡、理化因素及遺傳因素相關(guān)，因此建議自然流產(chǎn)胚胎進(jìn)行染色體檢查［7-8］。近年來，MLPA 技術(shù)在婦產(chǎn)科領(lǐng)域的應(yīng)用有了較大進(jìn)展，為產(chǎn)前篩查、產(chǎn)前診斷及自然流產(chǎn)的病因分析提供了新的技術(shù)方法。

有研究發(fā)現(xiàn)有超過61%的染色體異常檢出率［9］，這可能是因?yàn)檠芯咳后w不同結(jié)果的差異。本研究發(fā)現(xiàn)染色體非整倍體畸變占所有異常染色體的96.49%，以47，XN，+16 最為常見，其次為47，XN，+22 和45，XO，這三種異常占非整倍體異常的41.30%，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)染色體單體、染色體雙三體、嵌合體和其它復(fù)雜染色體非整倍體畸變等。有研究顯示，大部分染色體非整倍體畸變來源于卵母細(xì)胞減數(shù)分裂，尤其是第一次減數(shù)分裂時(shí)染色體不分離［10］，只有約0～8.5%的來自受精卵最初幾次的有絲分裂時(shí)染色體分離異常［11］。本次研究中，16-三體發(fā)生率最高，它發(fā)生在母親的卵母細(xì)胞中與其他的小染色體不同，它重組減少和不分離發(fā)生的確切機(jī)制還有待進(jìn)一步研究［12］，但有研究顯示在父親的減數(shù)分裂錯(cuò)誤中，16 號(hào)染色體的不分離可能對胎兒非整倍體產(chǎn)生相對影響［13］。45，XO在流產(chǎn)胚胎中的發(fā)生率為5.09%，與相關(guān)報(bào)道相近［14］。45，XO 是唯一已知的可存活單體（Turner綜合征），80%是父源性染色體丟失所致［15］。流產(chǎn)病例中還發(fā)現(xiàn)1 例45，XX，-4，2 例45，XN，-21，說明常染色體單倍體也可能是引起早孕期流產(chǎn)的原因。在流產(chǎn)胚胎中，發(fā)現(xiàn)14 例染色體部分缺失/重復(fù)。染色體部分缺失/重復(fù)會(huì)導(dǎo)致染色體不平衡，其與流產(chǎn)的相關(guān)性有待進(jìn)一步研究。但本研究中未發(fā)現(xiàn)涉及1 號(hào)染色體的非整倍體畸變，可能由于1 號(hào)染色體上涉及胚胎生命的基因較多，在更早期未被發(fā)現(xiàn)的流產(chǎn)中已流失。綜上，多種類型染色體畸變均有可能導(dǎo)致早期胚胎流產(chǎn)。

孕婦年齡已被證實(shí)與生殖細(xì)胞非整倍體的發(fā)生密切相關(guān)，在大于35 歲的孕婦中，卵細(xì)胞染色體非整倍體發(fā)生率明顯較高，確切原因尚未清楚，可能與高齡女性卵細(xì)胞減數(shù)分裂重組錯(cuò)誤、紡錘體聚合蛋白缺陷和Cohesion 蛋白減少等有關(guān)［16］，隨著孕婦年齡增加，胚胎染色體異常率也逐漸增加。研究發(fā)現(xiàn)，在年輕的流產(chǎn)孕婦中（35 歲以下），遺傳異常明顯較少，其流產(chǎn)原因可能存在其它因素的作用［17］。但在本研究中小于20 歲的孕婦中，其流產(chǎn)胚胎染色體異常檢出率到達(dá)74.14%，確切原因有待進(jìn)一步研究，可能與孕婦身體機(jī)制尚未發(fā)育成熟有關(guān)。

流產(chǎn)孕婦孕周小于12 周染色體異常檢出率明顯高于孕周大于或等于12 周人群，在自然流產(chǎn)發(fā)生時(shí)孕周越小，染色體異常的可能性就越大。在妊娠早期的流產(chǎn)胚胎染色體異常可能涉及任何一條或多條染色體，但孕周大于12 周的流產(chǎn)胎兒染色體異常大多為13，18，21 三體性和性染色體非整倍體，與在活產(chǎn)兒中能檢測到的染色體畸變類型相似［18］。

自然流產(chǎn)與多種因素相關(guān)，其中染色體非整倍體畸變是早期自然流產(chǎn)最常見的遺傳學(xué)病因。孕婦小于20 歲時(shí)，其流產(chǎn)胚胎染色體異常檢出率相當(dāng)高，孕婦在大于35 歲后，隨著年齡增大，流產(chǎn)胚胎染色體異常檢出率越高［19］，所以適齡婚育相當(dāng)重要。流產(chǎn)發(fā)生時(shí)的孕周越小，流產(chǎn)胚胎染色體異常檢出率越高，所以，對早期自然流產(chǎn)胚胎進(jìn)行遺傳學(xué)檢測對明確病因及進(jìn)一步優(yōu)生優(yōu)育咨詢具有重大意義。