胡澤斌 高飛 孫楠 孫彬裕 李麗莉 孫晶 曲守方 黃杰

人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）B27 抗原的表達(dá)與強(qiáng)直性脊椎炎有高度相關(guān)性，超過90%的強(qiáng)直性脊椎炎患者其HLA-B27 抗原表達(dá)為陽性，普通人群中僅5%～10%的為陽性［1-3］。迄今已有70 多種HLA-B27 亞型被發(fā)現(xiàn)和鑒定，在中國人群中B2705 和B2704 亞型分布最廣并且與強(qiáng)直性脊椎炎密切相關(guān)［4-6］。隨著基因檢測技術(shù)的發(fā)展和相關(guān)試劑盒的研發(fā)上市，基于聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）的HLA-B27 核酸檢測已成為臨床上的常用檢測手段［7-9］。然而目前，我國尚無針對HLA-B27 核酸檢測試劑盒的國家參考品，無法對此類試劑盒進(jìn)行統(tǒng)一的質(zhì)量評估。為確保HLA-B27 核酸檢測臨床測定結(jié)果可靠，為臨床診斷提供有力證據(jù)，中國食品藥品檢定研究院體外診斷試劑檢定所非傳染病診斷試劑室計(jì)劃研制一套能夠進(jìn)行HLA-B27 核酸檢測性能評價的國家參考品。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

人外周血淋巴細(xì)胞分離液、環(huán)孢霉素A 和二甲基亞砜，由北京索萊寶科技有限公司提供；基因組DNA 提取試劑盒（磁珠法），HLA 高分辨基因分型建庫試劑盒，Qubit?ssDNA Assay Kit（Invitrogen），MGISEQ-2000RS 高通量測序試劑套裝，由深圳華大智造科技有限公司提供；人類白細(xì)胞抗原B 位點(diǎn)基因高分辨分型試劑盒（測序法）由北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司提供；人類白細(xì)胞抗原B27 核酸檢測試劑盒（熒光PCR 法）由江蘇默樂生物科技股份有限公司提供；SeCore HLA B 位點(diǎn)測序分型試劑盒（測序法）由北京旌準(zhǔn)醫(yī)療科技有限公司提供；人類白細(xì)胞抗原B*27 基因分型試劑盒（SSP 法和熒光PCR 法）由江蘇偉禾生物科技有限公司提供。

1.1.2 主要儀器

MGISEQ-2000RS 測序儀由深圳華大智造科技有限公司提供；基因擴(kuò)增儀S1000（Bio-Rad）、基因分析儀3730xL（ThermoFisher）由北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司提供；SLAN-96P 全自動醫(yī)用PCR分析系統(tǒng)由江蘇默樂生物科技股份有限公司提供；ABI 3130/3130XL DNA 測序儀/基因分析儀由北京旌準(zhǔn)醫(yī)療科技有限公司提供；ABI GeneAmp-PCR System 9700、ABIReal-Time PCR Systems 7500由江蘇偉禾生物科技有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 樣本收集

招募自愿參與本項(xiàng)目的外周血捐獻(xiàn)者，并簽署了知情同意書。自2018年2月至2019年2月，共收集到HLA-B2704 陽性樣本2 例、HLA-B2705陽性樣本3 例、HLA-B27 陰性樣本8 例。采集志愿者10 mL 新鮮外周血，放入一次性肝素鈉/鋰或枸櫞酸鈉抗凝管采血管中，2～8℃保存運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室。核淋巴細(xì)胞，加入病毒液制備完全轉(zhuǎn)化液，進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)化與細(xì)胞培養(yǎng)、凍存。建立細(xì)胞系后進(jìn)行種子細(xì)胞系擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.2.2 國家參考品的制備與驗(yàn)證

將采集的志愿者外周血進(jìn)行永生化細(xì)胞系的建立［10-11］，按基因組DNA 提取試劑盒操作步驟，提取10 例成功建系的細(xì)胞基因組DNA，使用安捷倫NanoDorp 測定其OD260/OD280 值檢驗(yàn)純度，利用瓊脂糖凝膠電泳膠檢驗(yàn)DNA 的完整性。使用Qubit Fluorometer3.0 對10 例DNA 樣本進(jìn)行定量后稀釋至20 ng/μL 的濃度，采用高通量測序（next generation sequencing，NGS）技術(shù)對每個樣本驗(yàn)證。驗(yàn)證合格的DNA 樣本進(jìn)行分裝并貼上標(biāo)簽。

1.2.3 國家參考品的協(xié)作標(biāo)定

分別使用4 家協(xié)作標(biāo)定單位的HLA-B27 檢測試劑盒對國家參考品進(jìn)行協(xié)作標(biāo)定，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。測序法每個樣本測定1 次，PCR法每個樣本測定3 次。按照說明書的檢測限要求將參考品樣本稀釋之后進(jìn)行再次檢測。

1.2.4 國家參考品穩(wěn)定性和均勻性驗(yàn)證

隨機(jī)選取五套國家參考品，在-20℃與25℃之間反復(fù)凍融3 次（每隔1 天一次）之后，分別使用測序法、PCR 法、SSP 法的HLA-B27 檢測試劑盒對參考品進(jìn)行穩(wěn)定性驗(yàn)證。另外隨機(jī)取出三套國家參考品，使用測序法的HLA-B27 檢測試劑盒對參考品進(jìn)行均勻性驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 國家參考品的制備及驗(yàn)證

每套HLA-B27 國家參考品包括10 例基因組DNA 樣本（3 例HLA-B2705 陽性、7 例HLA-B27 陰性）。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示01-10 號樣本的DNA 條帶完整銳利，且分子量在23 kb 左右，見圖1。

01-10 號樣本的OD260/OD280 值均在1.80～2.15 之間，表明DNA 的純度較高符合檢測需求經(jīng)NGS 測序技術(shù)對每個樣本的HLA-B 位點(diǎn)進(jìn)行4 位高分辨基因分型檢測，HLA-B 位點(diǎn)的分型結(jié)果均與建系之前的外周血基因組DNA 的分型信息一致，最后按照30 μL 體積進(jìn)行分裝，貼標(biāo)簽，見表1。

2.2 國家參考品的協(xié)作標(biāo)定

實(shí)驗(yàn)室邀請4 家協(xié)作標(biāo)定單位（分別用A、B、C、D 代表），采用PCR-基因測序分型法（sequence based genotyping，SBT）、熒光PCR 法、和PCR--序列特異性引物法（sequence specific primer，SSP）對國家參考品進(jìn)行了驗(yàn)證，見表2。

2.3 國家參考品的穩(wěn)定性和均勻性驗(yàn)證

使用A 單位的HLA-B 位點(diǎn)基因高分辨分型試劑盒（SBT 法）對3 套參考品和2 套反復(fù)凍融3 次后的參考品進(jìn)行檢測，使用C 單位和D 單位的HLA-B27 核酸檢測試劑盒（PCR 法和SSP 法）對3 套反復(fù)凍融3 次后的參考品進(jìn)行檢測。見表3。

表1 10 例DNA 樣本的驗(yàn)證結(jié)果Table 1 Verification results of genomic DNA from 10 Samples

表2 4 家協(xié)作標(biāo)定單位的驗(yàn)證結(jié)果Table 2 Verification results of references by detection kits from 4 manufacturers

3 討論

大量研究數(shù)據(jù)表明，基于PCR 方法學(xué)的HLA-B27 核酸檢測已經(jīng)成為臨床輔助診斷強(qiáng)直性脊柱炎的常用方法［12-14］，而試劑盒的質(zhì)量是保障臨床診斷準(zhǔn)確的關(guān)鍵因素。然而不同企業(yè)不同方法學(xué)的試劑盒在檢測原理、原材料、生產(chǎn)工藝等方面均有所差異，在質(zhì)量控制和性能評價中使用各自的企業(yè)參考品，導(dǎo)致不同試劑盒的檢驗(yàn)結(jié)果缺乏可比性，建立標(biāo)準(zhǔn)化的國家參考品可以對不同試劑盒的質(zhì)量進(jìn)行統(tǒng)一評價。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是指具有一種或多種足夠均勻并且穩(wěn)定的具有準(zhǔn)確特性量值的測量標(biāo)準(zhǔn)，量值準(zhǔn)確性、足夠均勻性和良好穩(wěn)定性是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的三大重要特性［15-17］。本研究通過4 家實(shí)驗(yàn)室采用熒光PCR 法、PCR-SSP 法以及PCR-SBT 測序法的HLA-B27 檢測試劑對參考品進(jìn)行協(xié)作標(biāo)定，其中A 單位和B 單位兩家實(shí)驗(yàn)室均使用世界衛(wèi)生組織推薦的HLA 分型方法金標(biāo)準(zhǔn)即PCR-SBT 測序法，對10 例國家參考品（每一例均含2 條染色體）進(jìn)行4 位基因分型，結(jié)果完全一致；C 單位和D 單位兩家實(shí)驗(yàn)室使用熒光PCR 法、PCR-SSP 法的不同檢測試劑，對10 例國家參考品B27 的陰陽性結(jié)果進(jìn)行判斷，結(jié)果完全一致，以上數(shù)據(jù)充分保障了國家參考品的定值準(zhǔn)確。

表3 國家參考品穩(wěn)定性和均勻性的驗(yàn)證結(jié)果Table 3 Verification results of stability and homogeneity for references

本參考品是細(xì)胞系提取的基因組DNA 樣本，常規(guī)在在-20℃以下保存，且要求干冰或-20℃冷鏈運(yùn)輸，用戶不宜反復(fù)凍融后使用。DNA 樣本自身的均勻性和穩(wěn)定性是良好的。本研究通過3 家實(shí)驗(yàn)室采用PCR 法、PCR-SSP 法以及PCR-SBT 測序法，對3套國家參考品、以及5 套在-20℃與25℃之間反復(fù)凍融3 次之后的國家參考品進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示A 單位、C 單位和D 單位的驗(yàn)證結(jié)果均與-20℃保存的國家參考品的標(biāo)示結(jié)果完全一致，表明國家參考品在反復(fù)凍融3 次之后依然穩(wěn)定和均勻。此外，本參考品銷售半年以來，多家用戶使用后反饋良好，也表明了其穩(wěn)定性和均勻性良好；本實(shí)驗(yàn)室既往研制的多套DNA 參考品的穩(wěn)定性和均勻性實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及售后反饋，均表明DNA 參考品一直非常穩(wěn)定［18］；同時還將對該國家參考品進(jìn)行長期穩(wěn)定性研究以及期間核查，以確保長期放置后依然滿足要求。

由于測序法的HLA-B 核酸檢測試劑盒應(yīng)對待測樣本報告出HLA-B 的4 位基因分型信息，國家參考品在對此類試劑盒進(jìn)行性能評價時，10 例參考品均作為陽性參考品可對試劑盒的準(zhǔn)確性指標(biāo)進(jìn)行評價，10 例參考品稀釋后可對試劑盒的檢測限指標(biāo)進(jìn)行評價；其他方法學(xué)的HLA-B 核酸檢測試劑盒主要包括：熒光PCR 法、PCR-SSP 法、PCR-序列特異性寡核苷酸探針法（sequence specific oligonucleotide，SSO）、PCR 熔解曲線法，此類試劑盒一般針對B27 的常見亞型如B2705 和B2704 設(shè)計(jì)特異性引物，對待測樣本報告陰性或陽性的結(jié)果。7 例B27 陰性國家參考品可對試劑盒的特異性指標(biāo)進(jìn)行評價，3 例B27 陽性國家參考品可對試劑盒的準(zhǔn)確性和檢測限指標(biāo)進(jìn)行評價。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)室成功建立了人類白細(xì)胞抗原B27 核酸檢測國家參考品，該參考品的準(zhǔn)確性、均一性和穩(wěn)定性均符合要求，可用于人類白細(xì)胞抗原B27 核酸檢測試劑盒的質(zhì)量評價。