常立偉 楊東煒 劉東辰

目前乳腺癌已成為女性最為常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)均持續(xù)增長，具有較高的死亡率［1］。我國乳腺癌發(fā)病率也長期居高不下，且發(fā)病年齡呈年輕化趨勢，嚴重威脅女性健康狀況［2-3］。早期乳腺癌無明顯癥狀，發(fā)現(xiàn)困難，延誤治療現(xiàn)象嚴重。因此，針對乳腺癌病變的早期發(fā)現(xiàn)是目前醫(yī)學領(lǐng)域關(guān)注的重點?，F(xiàn)階段常用的診斷方法主要為一些影像學檢測手段，如乳腺B 超、乳腺鉬靶、磁共振等，但仍需要簡便操作、無創(chuàng)、價廉的血清腫瘤標志物提高診斷準確性［4］。根據(jù)美國臨床生化科學院（National Academy of Clinical Biochemistry，NACB）檢驗醫(yī)學時間指南推薦，已將糖類抗原125（carbohydrate antigen 125，CA125）、糖類抗原153（carbohydrate antigen 153，CA153）及癌胚抗原（carcino-embryonic antigen，CEA）等血清腫瘤標志物用于乳腺癌的診斷［5］。隨著分子生物技術(shù)的迅猛發(fā)展，循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTCs）、循環(huán)游離DNA（circulating free DNA，cfDNA）檢測在癌癥診療過程中的作用成為研究熱點［6］。本研究旨在探究血CTCs、cfDNA 聯(lián)合檢測在乳腺癌中的應(yīng)用價值，并分析血CTCs、cfDNA 水平與患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年4月至2016年4月經(jīng)手術(shù)治療的乳腺疾病患者163 例，其中85 例術(shù)后病理確診為乳腺癌（乳腺癌組），另78 例為乳腺良性疾病患者（良性疾病組），同時募集同期入院體檢健康女性50 例（對照組）。乳腺癌組患者平均年齡（45.46±11.62）歲；良性疾病組患者平均年齡（43.29±12.73）歲；對照組平均年齡（46.35±10.58）歲。3 組年齡資料比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。納入標準：乳腺癌患者經(jīng)術(shù)后病理檢測確診，且為首次、單側(cè)發(fā)病；具有手術(shù)指征；簽署知情同意書。排除標準：患者術(shù)前接受放化療、內(nèi)分泌治療等；合并其他惡性腫瘤；嚴重心、肝、腎等功能不全；合并出血性疾病；存在嚴重系統(tǒng)性疾病或感染；處于妊娠、哺乳期女性；精神異常，存在溝通障礙。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準，各組受試者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 病例資料及樣本采集

收集受試者一般人口學資料和疾病相關(guān)資料，并采集受試者空腹下肘部靜脈血5 mL，室溫靜置后待測。

1.2.2 血CTCs 檢測

采用免疫磁珠陰性富集法富集血液樣本中的細胞，進行熒光原位雜交實驗，再通過免疫熒光染色定位CTCs 細胞，最后熒光顯微鏡下計數(shù)CTCs和判讀結(jié)果。判讀標準：以2 個CTCs/3.2 mL 血液為臨界值，任一探針信號點＞2 個，無血源性白細胞表面抗原著色時，可計為1 個陽性細胞，陽性細胞＞1 個時即為陽性［7］。

1.2.3 血cfDNA、腫瘤標志物檢測

分離樣本血漿，參照QIAGEN 血液基因組DNA 純化試劑盒（批號：51106）說明書操作，提取血漿DNA，采用熒光定量PCR 檢測血漿DNA 含量。其中GADPH 上游引物：5′GGAAGGTGAA GGTCGGAGTC3′，下游引物：5′GAAGATGGTGA TGGGATTC3′，探針序列：5′FAM-CAAGCTTCC CGTTCTCAGCC-TAMRA3′。以≥1×103基因拷貝數(shù)為陽性標準［8］。

應(yīng)用全自動微粒子化學發(fā)光酶免疫分析儀，檢測樣本血清中CA125、CA153 及CEA 的濃度，其中各指標陽性標準為：CA125＞35 U/mL，CA153＞31.5 U/mL，CEA＞5 U/mL，聯(lián)合檢測時任一指標超標即為陽性［9］。

1.2.4 術(shù)后隨訪

術(shù)后通過門診復(fù)查形式隨訪1年，隨訪時間截止2019年4月30日，記錄患者疾病進展情況，將其中出現(xiàn)疾病進展的患者作為疾病進展組，剩余患者作為無疾病進展組，比較兩組血CTCs、cfDNA水平。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用軟件SPSS 17.0 分析處理數(shù)據(jù)，計量資料以（±s）表示，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q法；計數(shù)資料以n（%）表示，采用χ2檢驗；采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線描述血CTCs、cfDNA 對于乳腺癌診斷的可行性，以曲線下面積（area under the curve，AUC）大小表示其診斷價值，組間比較采用Z檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血清CTCs、cfDNA、CA125、CA153 及CEA 水平的比較

各組血清CTCs、cfDNA、CA125、CA153 及CEA 水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其中乳腺癌組上述指標水平明顯高于良性疾病組和對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但良性疾病組和對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 各組血CTCs、cfDNA、CA125、CA153 及CEA 水平的比較（±s）Table 1 Comparison on levels of serum CTCs，cfDNA，CA125，CA153 and CEA among all groups（±s）

表1 各組血CTCs、cfDNA、CA125、CA153 及CEA 水平的比較（±s）Table 1 Comparison on levels of serum CTCs，cfDNA，CA125，CA153 and CEA among all groups（±s）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與良性疾病組比較，bP＜0.05。

指標CTCs（個）cfDNA（×103基因拷貝數(shù)）CA125 CA153 CEA乳腺癌組（n=85）1.34±0.29ab 29.65±8.57ab 22.37±7.24ab 35.84±11.62ab 6.69±2.13ab良性疾病組（n=78）0.03±0.01 0.05±0.01 16.21±5.20 9.13±2.65 1.85±0.54對照組（n=50）0.00±0.00 0.03±0.01 15.43±4.67 8.87±2.41 1.76±0.42 F 值1325.262 762.096 29.931 316.891 309.314 P 值＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

2.2 血CTCs、cfDNA 診斷乳腺癌的ROC 分析

ROC 分析血CTCs、cfDNA 單獨或聯(lián)合及三項聯(lián)合檢測診斷乳腺癌的AUC 高于傳統(tǒng)腫瘤標志物診斷，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但cfDNA、CTCs+cfDNA 及三項聯(lián)合檢測間兩兩AUC 比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2、圖1。

2.3 血CTCs、cfDNA 水平與乳腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系

腫瘤大小≥2 cm 乳腺癌患者血CTCs 陽性率高于腫瘤大?。? cm 者，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），CTCs 陽性率在不同年齡、病理類型、絕經(jīng)情況、TNM 分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者間的比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者cfDNA 陽性率高于無轉(zhuǎn)移者，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），cfDNA 陽性率在不同年齡、病理類型、絕經(jīng)情況、腫瘤大小、TNM 分期、分化程度患者間的比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表3。

2.4 血CTCs、cfDNA水平與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系截止2019年4月30日，85 例乳腺癌患者術(shù)后

有22 例出現(xiàn)疾病進展，其中疾病進展者CTCs、cfDNA 陽性率分別為19（86.36%）和22（100.00%），均高于無疾病進展組34（53.97%）和49（77.78），差異具有統(tǒng)計學意義（χ2=7.290，P＜0.05）。

表3 血CTCs、cfDNA 水平與乳腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系［n（%）］Table 3 Relationship between serum CTCs，cfDNA levels and clinicopathological features of breast cancer patients［n（%）］

3 討論

CTCs 是外周血中的各類腫瘤細胞的總稱，這些細胞大多是原發(fā)腫瘤部位、復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移病灶脫落從而進入血液循環(huán)，具有與腫瘤特異性相關(guān)的抗原蛋白質(zhì)和遺傳變異表達［10］。cfDNA 是外周血游離的DNA 總稱，常以蛋白復(fù)合體形式存在，包括腫瘤來源的DNA 和正常細胞來源的DNA。由于癌癥患者血漿中核酸酶活性降低，cfDNA 的清除率降低，導(dǎo)致癌癥患者cfDNA 濃度高于健康者［11］。故檢測cfDNA 水平可實時監(jiān)測癌組織情況。張瀟分等［12］研究指出，CTCs 和cfDNA 可能是乳腺癌輔助診斷的潛在生物學標志。本研究結(jié)果提示CTCs、cfDNA 在乳腺癌的診斷中均具有較高價值，與上述文獻結(jié)果基本相符。但考慮CTCs 和cfDNA 的檢測方法和陽性標準不同，后續(xù)還需要加大樣本量進行驗證。CA125、CA153 及CEA 是常用的乳腺癌診斷血清標志物，上述指標對于乳腺癌均有較高的敏感性，但特異性較差［13］。本研究將聯(lián)合檢測中任一指標陽性指定為陽性結(jié)果進一步說明血CTCs、cfDNA 聯(lián)合檢測對于乳腺癌的早期診斷有較高的應(yīng)用價值。在本研究中，比較3種不同檢查方法單獨或聯(lián)合及部分聯(lián)合的診斷價值，在國內(nèi)外相關(guān)報道較少。

乳腺癌的臨床治療主要依據(jù)患者臨床病理特征，因此，分析乳腺癌的臨床病理特征與CTCs、cfDNA 的關(guān)系也是十分必要的。既往研究顯示，CTCs 陽性與乳腺癌的臨床分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)狀態(tài)及相關(guān)抗體表達有關(guān)［13］。而血cfDNA 檢測作為一種液體活檢，可動態(tài)評估乳腺癌患者臨床療效及預(yù)后［14］。本研究結(jié)果提示腫瘤直徑越大，腫瘤細胞脫落進入血液循環(huán)的可能性更大；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者cfDNA 陽性率高，可能是腫瘤細胞活躍增殖時釋放更多DNA 進入血循環(huán)。但本研究中其他臨床病理特征與CTCs、cfDNA 水平無明顯相關(guān)性，后續(xù)將納入更多研究對象深入分析其相關(guān)性。另外，術(shù)后隨訪結(jié)果顯示，疾病進展患者CTCs、cfDNA 陽性率要高于無疾病進展組，與文獻報道血CTCs、cfDNA可評估乳腺癌患者預(yù)后的結(jié)果相符［15-16］。

綜上所述，血CTCs、cfDNA 檢測對于乳腺癌有較高的診斷價值，且與患者臨床病理特征及預(yù)后密切相關(guān)，可為乳腺癌患者的早期診斷和個體化治療提供可靠依據(jù)。但目前血CTCs、cfDNA 診斷乳腺癌患者的截斷值尚未有確切定義，還需要不斷優(yōu)化檢測技術(shù)和數(shù)據(jù)分析方法，提高其臨床利用率。