（長治職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山西 長治 046000）

傳統(tǒng)的嫁接是一種營養(yǎng)繁殖方式。前人已經(jīng)證明嫁接可以導(dǎo)致砧木和接穗之間的水平基因轉(zhuǎn)移[1]。然而，尚未報(bào)道通過嫁接在作物育種中進(jìn)行水平基因轉(zhuǎn)移的應(yīng)用。通過組織培養(yǎng)方法（GTCM）創(chuàng)建了一種新的類似移植方法，以促進(jìn)不同材料之間細(xì)胞質(zhì)遺傳物質(zhì)的水平交換。

胞間連絲是一種細(xì)胞間通道，在細(xì)胞間可以交換各種分子，包括核酸、蛋白質(zhì)、離子、水甚至病毒[2]。作物雜種優(yōu)勢利用的主要方法是CMS 系統(tǒng)，遺傳雄性不育系統(tǒng)（GMS），自交不親和系統(tǒng)，雄性不育系的基因工程，化學(xué)雜交劑等。CMS 系統(tǒng)是不育系的細(xì)胞質(zhì)和核相互作用的結(jié)果。在這種類型的CMS 中，想要實(shí)現(xiàn)保持系，傳統(tǒng)的方法是人工合成保持系。整個(gè)過程需要雜交，測試和自交多代，大面積種植[3]。

由于砧木和接穗之間的遺傳物質(zhì)的交換不會(huì)在遠(yuǎn)距離的情況下發(fā)生，通過組織培養(yǎng)法（GTCM）創(chuàng)造了一種新的類似嫁接法，可廣泛應(yīng)用于不同種質(zhì)之間的細(xì)胞質(zhì)遺傳物質(zhì)的交換。即使在不同的物種之間也可以使用這種改進(jìn)的方法。步驟如下，首先，在無菌環(huán)境中將2 種類型的嫩莖切成2 種不同的大小。其次，來自2種類型種質(zhì)的愈傷組織接合在一起生長并形成整體，其中一些細(xì)胞質(zhì)遺傳物質(zhì)相互交換和轉(zhuǎn)移。第三，相互作用的愈傷組織在不同的培養(yǎng)基中分化，再生和生長芽和根。最后，分子鑒定和表型確認(rèn)進(jìn)一步驗(yàn)證了陽性細(xì)胞系。

1 材料和方法

物料A：供體材料，細(xì)胞質(zhì)雄性不育系Ogu89，半冬甘藍(lán)型油菜不育系；B：受體材料，隱性正常細(xì)胞質(zhì)育性系，中雙11 號是2008 年在我國發(fā)布的優(yōu)良半冬甘藍(lán)型油菜品種；通過從Ogu89 到中雙11 的細(xì)胞質(zhì)遺傳物質(zhì)的水平轉(zhuǎn)移開發(fā)隱性CMS 保持系。

通過組織培養(yǎng)方法在不同材料之間水平轉(zhuǎn)移遺傳物質(zhì)[4]。詳細(xì)過程（7 個(gè)步驟）描述如下：

1.1 材料準(zhǔn)備

將來自A 供體材料（Ogu89）和B 受體材料（中雙11）的種子浸泡約24h，挑出腐敗種子浸入95%乙醇中1min，用無菌水清洗種子2～3 次，在1%氯化汞中連續(xù)洗滌15min，再用無菌水洗滌3～4 次。最后，在MS 培養(yǎng)基上播種。

MS 培養(yǎng)基配方：4.4g/LMS 粉末+20g/L 蔗糖+2.6g/L植物凝膠。

1.2 采用組織培養(yǎng)法和外植體去分化材料相似接枝

當(dāng)幼苗的下胚軸伸長約10cm 時(shí)，將材料A（Ogu89）切成約5mm 的片段，將B（中雙11）切成10mm的片段。然后，將2 種類型的切割段與切口對接接觸，置于去分化介質(zhì)上。

去分化培養(yǎng)基配方：4.4g/L MS 粉+1 mg/L 2，4-D+1 mg/L 6-BA+30 g/L 蔗糖+2.6g/L 植物凝膠。

1.3 去分化后的外植體再生

2 周后，分化的愈傷組織出現(xiàn)在誘導(dǎo)再生培養(yǎng)基中。將2 種類型的外植體轉(zhuǎn)移到誘導(dǎo)再生培養(yǎng)基上。

再生培養(yǎng)基：4.4g/L MS 粉+4mg/L 6-BA+2 mg/L ZT+5mg/L AgNO3+30 g/L 蔗糖+2.6 g/L 植物凝膠。

1.4 外植體分化

2 周后，在切割段的切割位置出現(xiàn)分化的綠色和白色致密愈傷組織。2 種類型的片段一起轉(zhuǎn)移到分化芽的培養(yǎng)基中，切割段的愈傷融合并一起生長。

分化芽培養(yǎng)基：4.4g/LMS 粉+3mg/L 6-BA+2mg/L ZT+30g/L 蔗糖+2.6 g/L 植物凝膠。

1.5 觀察外植體和莖分化的生長

每2 周更換1 次培養(yǎng)基。觀察分化培養(yǎng)基中愈傷組織的變化。愈傷分化成葉片相似的組織。如果沒有出現(xiàn)類似葉子的組織，則仍然需要將培養(yǎng)的外植體置于分化芽培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

分化莖培養(yǎng)基：4.4g/LMS 粉+0.005mg/L6-BA+30g/L蔗糖+2.6g/L 植物凝膠。

1.6 小苗馴化

當(dāng)外植體在分化莖干培養(yǎng)基中，生長成具有4～5片葉子和3～4 根纖維根小的整合植物時(shí)，打開培養(yǎng)盆使幼苗適應(yīng)外部環(huán)境。2～3d 后，取出植物，清洗根部周圍的培養(yǎng)基，并將其移植到帶有營養(yǎng)土壤的盆容器中。在充足的陽光下自然生長并定期施肥[5]。

1.7 用分子標(biāo)記和表型測試篩選并確認(rèn)陽性細(xì)胞系

對參與細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的Ogu89 和中雙11，采用蔗糖密度梯度從黃化幼苗中提取線粒體DNA，在25℃黑暗中生長4d，提取總DNA 以對可育基因進(jìn)行分子檢測。Ogu 細(xì)胞質(zhì)雄性不育系具有465bp 的簡單序列重復(fù)（SSR）標(biāo)記，其與調(diào)節(jié)Ogu 不育的Orf138 基因緊密連結(jié)。通過使用特異性引物檢測，使用mtDNA 特異性引物擴(kuò)增PCR。試驗(yàn)需要具有Ogu89 CMS 的核遺傳物質(zhì)和中雙11 隱性生育系的正常細(xì)胞質(zhì)的品系。

2 結(jié)果與分析

2.1 隱性CMS 保持系的開發(fā)

在MS 培養(yǎng)基上分別播種了80 粒Ogu89（不育系）和中雙11（優(yōu)良品系）種子。Ogu89 的77 粒種子和中雙11 粒的50 粒種子長成了幼苗。采用組織培養(yǎng)法進(jìn)行相似移植后，分化后得到156 個(gè)外植體。分化和再生過程后，成功轉(zhuǎn)移了105 個(gè)外植體（67.3%）。最后，實(shí)現(xiàn)了約30 棵幼苗。

2.2 篩選并確認(rèn)陽性植株

在Murashige 和Skoog（MS）培養(yǎng)基上分別播種了80 粒Ogu89（不育系）和中雙11（優(yōu)良品系）種子。Ogu89 的77 粒種子和中雙11 粒的50 粒種子長成了幼苗。采用組織培養(yǎng)法進(jìn)行相似移植后。去分化后得到156 個(gè)外植體。分化和再生過程后，成功轉(zhuǎn)移了105 個(gè)外植體（67.3%）。最后，實(shí)現(xiàn)了約30 棵幼苗。

圖1 使用分子標(biāo)記檢測轉(zhuǎn)移的細(xì)胞質(zhì)不育基因

Ogu 細(xì)胞質(zhì)雄性不育系具有465bp 的簡單序列重復(fù)（SSR）標(biāo)記，與調(diào)節(jié)Ogu 不育的Orf138 基因緊密聯(lián)系。通過Orf138 基因的特異性引物擴(kuò)增的PCR 產(chǎn)物中出現(xiàn)了465bp 的條帶（如圖1）。顯示了測試結(jié)果，然后驗(yàn)證了成功轉(zhuǎn)換的真實(shí)性。需要的是具有Ogu89 CMS核遺傳物質(zhì)和中雙11 隱性生育系正常細(xì)胞質(zhì)的品系。結(jié)合表型性狀和基因型鑒定的結(jié)果，最終獲得了3 株具有正常生育力和農(nóng)藝性狀的植物，這些植物與雄性不育系相似。因此，1/10 的幼苗（3/30 幼苗）和1.9%外植體（3/156 外植體）可以從CMS 系轉(zhuǎn)移到受體。

3 結(jié)論與討論

在隱性CMS 系統(tǒng)中，大多數(shù)種質(zhì)可以恢復(fù)不育系的繁殖力。傳統(tǒng)方法則需要多次回交。然而，遺傳物質(zhì)在不育系和攜帶正常細(xì)胞質(zhì)可育基因的恢復(fù)系之間的水平轉(zhuǎn)移，可從后代中選擇保持系，通過這種改良的組織培養(yǎng)方法獲得，節(jié)省了大量種植，縮短繁殖時(shí)間，降低繁殖成本。

本研究中的技術(shù)（GTCM）可以快速實(shí)現(xiàn)CMS 基因從相關(guān)野生物種到栽培品種的低水平轉(zhuǎn)移。將轉(zhuǎn)化質(zhì)體的靶基因從一個(gè)種質(zhì)快速水平轉(zhuǎn)移到另一個(gè)種質(zhì)，由于質(zhì)體轉(zhuǎn)化具有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，它受到越來越多的關(guān)注。該GCTM 技術(shù)可以使具有轉(zhuǎn)基因質(zhì)體和非轉(zhuǎn)基因品系的愈傷組織一起生長以形成整體，并分化成正常植物。經(jīng)過分子和表型確認(rèn)后，篩選成功轉(zhuǎn)化的植物。

在試驗(yàn)過程中，會(huì)遇到以下問題：（1）組織培養(yǎng)中的操作必須小心和標(biāo)準(zhǔn)。應(yīng)避免污染。否則可能導(dǎo)致整個(gè)試驗(yàn)失敗。確保使用的所有設(shè)備都無菌。為了達(dá)到預(yù)期的結(jié)果，重復(fù)組織培養(yǎng)過程非常必要。

（2）影響培養(yǎng)細(xì)胞生長和芽再生的因素很多，如抗生素。根據(jù)現(xiàn)有方案，胚胎發(fā)生愈傷組織來自下胚軸胚發(fā)生培養(yǎng)物。胚胎發(fā)生愈傷組織在MS 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，胚萌發(fā)和植物再生。MS 培養(yǎng)基由補(bǔ)充有6.8mM 谷氨酰胺，3.8mM 天冬酰胺，3%（w/v）蔗糖，0.3%植物凝膠和2μM6-BA，2μM2，4D 的無機(jī)鹽組成。

總之，GTCM 技術(shù)使能夠快速開發(fā)隱性CMS 的保持系，將不育基因從相關(guān)的野生物種轉(zhuǎn)移到栽培品種，甚至在具有更遠(yuǎn)遺傳距離和雜交不相容性的物種之間轉(zhuǎn)移，并將轉(zhuǎn)化質(zhì)體的快速靶向基因，從一個(gè)種質(zhì)轉(zhuǎn)移到另一個(gè)是在低成本和高效率的條件下。