王蕾蕾 華姞安 孟靚 魏益謙 孟智睿 賈嵐 高學(xué)敏 王景霞

青錢柳Cyclocaryapaliurus是中國(guó)特有的珍稀樹種資源，《中國(guó)中藥資源志要》中記載青錢柳葉具有“清熱解毒，生津止渴”的功效。研究發(fā)現(xiàn)，青錢柳葉具有降血糖、降血脂、抗氧化等作用[1-2]。糖尿病屬于中醫(yī)“消渴病”的范疇，具有陰虛為本，內(nèi)熱為標(biāo)的病機(jī)特點(diǎn)，臨床常使用藥性寒涼的養(yǎng)陰生津藥物治療。課題組的前期研究顯示青錢柳葉對(duì)2型糖尿病大鼠具有顯著的降血糖作用，可以調(diào)節(jié)胰島素的分泌，抑制氧化應(yīng)激對(duì)組織器官結(jié)構(gòu)的影響[3-5]，能夠緩解高血糖大鼠早期腎損傷，具有調(diào)節(jié)腎損傷標(biāo)志物的作用[6]。本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上，采用高脂飼料喂養(yǎng)結(jié)合皮下注射甲狀腺素及一次性腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素 (streptozotocin，STZ)誘導(dǎo)建立陰虛證型2型糖尿病大鼠的病證結(jié)合動(dòng)物模型[7]，探討青錢柳葉對(duì)陰虛型2型糖尿病大鼠證侯指標(biāo)及糖脂代謝的影響，為進(jìn)一步深入研究青錢柳的功效和藥性特點(diǎn)奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠，8周齡，體重在180～200 g。購(gòu)買于斯貝福(北京)動(dòng)物科技有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：(SCXK(京)2016-0002)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)在北京中醫(yī)藥大學(xué)屏障環(huán)境動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。高脂飼料配方中每100 g高脂飼料中含有：10 g豬油、15 g蔗糖、15 g蛋黃粉、5 g酪蛋白、1.2 g膽固醇、0.2 g膽酸鈉、0.6 g碳酸氫鈣、0.4 g石粉、52.6 g普通飼料，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑

實(shí)驗(yàn)藥物：青錢柳葉水提物干膏(無(wú)限極中國(guó)有限公司提供本研究用)，制備方法：5 kg原料，第一次加12倍水，煮沸保持微沸2小時(shí)，過(guò)濾，濾渣再加10倍水，煮沸保持微沸1小時(shí)，過(guò)濾合并2次濾液，濃縮干燥成干膏，粉碎過(guò)80目篩，干燥保存待用。知柏地黃丸(九芝堂股份有限公司，360丸/瓶)。

實(shí)驗(yàn)試劑：鏈尿佐菌素(streptozotocin，SIGMA公司，批號(hào)：WXBC3087V)，檸檬酸鈉緩沖液(索萊寶公司，批號(hào)：20180830)，L-甲狀腺素鈉(北京百諾威生物科技有限公司，批號(hào)：20190320)，總膽固醇試劑盒(TC，批號(hào)：20190320)，甘油三酯試劑盒(TG，批號(hào)：20190320)，高密度脂蛋白試劑盒(HDL批號(hào)：20190320)，低密度脂蛋白試劑盒(LDL，批號(hào)：20190320)，游離胰島素試劑盒(FINS，批號(hào)：20190320)，三碘甲狀腺原氨酸試劑盒(T3，批號(hào)：20190320)，甲狀腺素試劑盒(T4，批號(hào)：20190320)，環(huán)磷酸腺苷試劑盒(cAMP，批號(hào)：20190320)，環(huán)磷酸鳥苷試劑盒(cGMP，批號(hào)：20190320)，以上試劑盒購(gòu)買于北京華英生物技術(shù)研究所。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司，PL-203)，超聲細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物，JY92-IIn)，臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Heal Force，Neofuge 15R)，純水儀(青島富勒姆科技，F(xiàn)BZ2001-UP-P)，渦旋混合器(Servicebio，MX-F)，超低溫冰箱(海爾，DW-86L626)，全自動(dòng)生化分析儀(深圳雷杜生命科技，Chemray 240)，全自動(dòng)研磨儀(武漢賽維爾生物有限公司，KH-III)，酶標(biāo)檢測(cè)儀(BioTeK，Epoch)，自動(dòng)洗板機(jī)(Rayto，RT3100)，穩(wěn)豪倍易型血糖儀和血糖試紙(強(qiáng)生上海醫(yī)療器械有限公司)。

1.4 動(dòng)物造模、分組及給藥

雄性SD大鼠60只，先適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，將大鼠隨機(jī)分為空白組7只和造模組53只。其中空白組給予普通飼料，造模組高脂飼料喂養(yǎng)8周。第9周，以0.2 mg/kg的劑量皮下注射甲狀腺素溶液1周，造模組以30 mg/kg的劑量一次性腹腔注射2%的STZ溶液(現(xiàn)用現(xiàn)配，取適量STZ，錫紙避光于冰塊之中避光保存，用0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液在冰浴中配置溶液，pH=4.5)，并于72小時(shí)后禁食不禁水8小時(shí)，尾尖靜脈取血測(cè)FBG >11.1 mmol/L為造模成功，注射STZ后，大鼠死亡3只，成模40只，隨機(jī)取成模大鼠7只，空白大鼠7只，計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(homeostasis model assessment for insulin resistance，HOMA-IR)、胰島素作用指數(shù)(insulin action index，IAI)。剔除空腹血糖>30 mmol/L的大鼠5只，選擇35只成模大鼠納入實(shí)驗(yàn)。隨機(jī)分為模型組，知柏地黃丸組，CPE低、中、高劑量組，每組納入7只成模大鼠。

根據(jù)10 mL/kg給藥體積計(jì)算，空白組和模型組大鼠灌胃無(wú)菌水，知柏地黃丸組給藥劑量為0.3 g/kg，青錢柳葉水提物(CPE)低、中、高劑量組按干膏灌胃劑量分0.25、0.5、1 g/kg，連續(xù)給藥4周。在給藥期間，全組大鼠喂食普通飼料，自由進(jìn)食和飲水。

1.5 血液樣品的制備與指標(biāo)檢測(cè)

開始給藥后，每間隔1周禁食(自由飲水)8小時(shí)，尾靜脈采血檢測(cè)空腹血糖(FBG)，稱重記錄體重變化。給藥4周后，禁食不禁水8小時(shí)，先灌胃CPE，30分鐘后，尾尖靜脈取血測(cè)定灌胃葡萄糖后0小時(shí)血糖，灌胃葡萄糖溶液(2.0 g/kg)，測(cè)定灌胃葡萄糖后0.5 小時(shí)、2 小時(shí)的血糖值，計(jì)算血糖曲線下面積。血糖曲線下面積(AUC)計(jì)算公式如下：1/2×(0小時(shí)的血糖值+0.5 小時(shí)的血糖值)×0.5+1/2×(2 小時(shí)的血糖值+0.5 小時(shí)的血糖值)×1.5；采用酶免法測(cè)FINS含量，計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)、胰島素作用指數(shù)(IAI)。HOMA-IR：FINS/22.5e-lnFBG ≈(FBG×FINS)/22.5，IAI:LN(1/HOMA-IR)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，經(jīng)由腹主動(dòng)脈采血，冷凍離心分離血清，檢測(cè)T3、T4、cAMP、cGMP的含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 一般狀態(tài)觀察

實(shí)驗(yàn)期間觀察大鼠的狀態(tài)，皮下注射T4一周后，情緒急躁，有聲響即抬頭，活動(dòng)增加，毛發(fā)枯黃，易脫落，飲水量、進(jìn)食量增加，舌紅，唇紅，爪淡紅，小便黃，大便干。注射STZ后，情緒急躁，有聲響即抬頭，好動(dòng)撕咬，毛發(fā)枯黃，無(wú)光澤，易脫落，飲水量、飲食量顯著增加，舌色鮮紅，唇色暗紅，爪色紅，小便多，大便干，色黑，出現(xiàn)陰虛的證候表現(xiàn)。在給藥后，模型大鼠毛發(fā)恢復(fù)光澤，脫落減少，自主活動(dòng)正常，舌色紅，唇紅，爪色淡紅，大便干色黑。

2.2 CPE對(duì)陰虛型T2D大鼠體重的影響

與空白組進(jìn)行比較，模型組大鼠體重顯著降低(P<0.01)。與模型組進(jìn)行比較，知柏地黃丸組大鼠第1周至第4周體重顯著增加(P<0.01)，CPE高劑量組體重顯著增加(P<0.01)，見表1。

表1 青錢柳對(duì)陰虛型T2D大鼠體重的影響

2.3 CPE對(duì)陰虛型T2D大鼠FBG的影響

與空白組進(jìn)行比較，模型組大鼠FBG值第1周至第4周顯著地升高(P<0.01)。與模型組進(jìn)行比較，知柏地黃丸組第1周至第4周FBG顯著降低(P<0.01)；第1周CPE中、高劑量組FBG顯著降低(P<0.01)，第2周CPE低、高劑量組FBG顯著降低(P<0.05，P<0.01)，第3周CPE低、中、高劑量組FBG顯著降低(P<0.05，P<0.01)，第4周CPE高劑量組FBG顯著降低(P<0.01)，見表2。

表2 青錢柳對(duì)陰虛型T2D大鼠FBG的影響

2.4 CPE對(duì)陰虛型T2D大鼠糖耐量的影響

與空白組進(jìn)行比較，模型組0 小時(shí)、0.5小時(shí)、2小時(shí)血糖，AUC顯著升高(P<0.01)。與模型組進(jìn)行比較，知柏地黃丸組0 小時(shí)、2 小時(shí)血糖，AUC顯著降低(P<0.01)；CPE高劑量組AUC顯著下降(P<0.01)，見表3。

表3 青錢柳對(duì)陰虛型T2D大鼠糖耐量的影響

2.5 CPE對(duì)陰虛型T2D大鼠FINS、HOMA-IR、IAI的影響

與空白組進(jìn)行比較，模型組的FINS、HOMA-IR顯著升高(P<0.01)，IAI顯著下降(P<0.01)。與模型組進(jìn)行比較，知柏地黃丸組的HOMA-IR顯著下降(P<0.01)，IAI顯著升高(P<0.01)；CPE低、高劑量組HOMA-IR降低(P<0.05)；CPE低、高劑量組IAI顯著升高(P<0.05，P<0.01)。見表4。

表4 青錢柳對(duì)陰虛型T2D大鼠FINS、HOMA-IR、IAI的影響

2.6 CPE對(duì)陰虛型T2D大鼠血脂的影響

與空白組進(jìn)行比較，模型組大鼠血清中TC、TG、LDL顯著地升高，HDL明顯地降低(P<0.05，P<0.01)；與模型組進(jìn)行比較，知柏地黃丸組TG、LDL顯著下降(P<0.01)；CPE中劑量組血清LDL顯著下降(P<0.01),CPE高劑量組血清TC、TG、LDL顯著下降(P<0.01，P<0.05)，CPE低、中、高劑量組HDL有升高的趨勢(shì)，但各組間的差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表5。

表5 青錢柳對(duì)陰虛型T2D大鼠血脂的影響

2.7 CPE對(duì)陰虛型T2D大鼠的T3、T4、cAMP、cGMP的影響

造模后與空白組進(jìn)行比較，模型組大鼠血清中T3、T4、cAMP、cGMP的含量顯著地升高(P<0.01，P<0.05)；與模型組比較，知柏地黃丸組T3、T4、cAMP、cGMP顯著下降(P<0.01,P<0.05)；CPE低、高劑量組血清中T3、T4顯著下降(P<0.01,P<0.05)，CPE低、中、高劑量組血清cAMP、cGMP顯著下降(P<0.01)。見表6。

表6 青錢柳對(duì)陰虛型T2D大鼠的T3、T4、cAMP、cGMP的影響

3 討論

中醫(yī)的陰虛證侯主要表現(xiàn)為五心煩熱，咽干顴紅，形體消瘦，小便短黃或大便干結(jié)，舌紅少津等癥狀。采用大劑量甲狀腺素激素注射，可使大鼠表現(xiàn)出好動(dòng)，易怒，毛發(fā)枯槁，飲水量和進(jìn)食量增加，體重下降，小便黃，大便干結(jié)等癥狀，與臨床上腎陰虛患者的癥狀相似，能很好地模擬陰虛的證候表現(xiàn)[8]。故本實(shí)驗(yàn)采用高脂飼料喂養(yǎng)大鼠8周后，皮下注射甲狀腺素溶液1周，再結(jié)合一次性腹腔注射小劑量STZ誘導(dǎo)建立陰虛證型2型糖尿病大鼠的病證結(jié)合動(dòng)物模型。

T3、T4作為下丘腦-垂體-甲狀腺軸中甲狀腺分泌的關(guān)鍵激素，調(diào)節(jié)機(jī)體產(chǎn)熱的功能，同時(shí)還有調(diào)控機(jī)體能量代謝的作用[9]。近年有研究表明T3、T4可能是陰虛證型的證候指標(biāo)，陰虛患者血清中的T3、T4明顯升高[10]。有研究認(rèn)為T3、T4可以作為糖尿病陰虛內(nèi)熱證的證候觀察指標(biāo)[11]。cAMP、cGMP作為“第二信使”參與細(xì)胞內(nèi)能量的代謝，調(diào)控能量代謝信號(hào)的正常傳遞，是機(jī)體內(nèi)能量代謝的重要標(biāo)志[12]。研究顯示虛熱證模型大鼠血清中cAMP、cGMP都顯著地升高，其可能是陰虛與陽(yáng)虛的證候標(biāo)志[13]。

在本實(shí)驗(yàn)中，與空白組進(jìn)行比較，模型組大鼠出現(xiàn)多飲、多食、多尿“三多一少”的癥狀，還出現(xiàn)了情緒急躁，有聲響即抬頭，撕咬好動(dòng)，毛發(fā)枯黃，無(wú)光澤，易脫落，體重下降，舌色鮮紅，唇色暗紅，爪色紅，大便干，色黑等癥狀，T3、T4、cAMP、cGMP顯著升高，說(shuō)明模型大鼠的陰虛證候表現(xiàn)明顯；空腹血糖、HOMA-IR明顯升高，IAI下降，說(shuō)明模型大鼠機(jī)體內(nèi)存在胰島素抵抗，血脂四項(xiàng)也出現(xiàn)異常，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[7, 14]，提示陰虛型2型糖尿病病證結(jié)合模型造模成功。

給予青錢柳葉水提物治療后，模型大鼠體重逐漸增加，毛色恢復(fù)光澤，毛發(fā)脫落減少，情緒較為穩(wěn)定，陰虛證侯表證得到一定的緩解。血糖動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)顯示青錢柳葉水提物能夠穩(wěn)定地控制血糖，而且青錢柳葉不僅能降低HOMA-IR指數(shù)，提高IAI指數(shù)，有效緩解胰島素抵抗，同時(shí)可使實(shí)驗(yàn)大鼠的TG、TC、LDL顯著降低，HDL有升高的趨勢(shì)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，青錢柳葉可降低陰虛型2型糖尿病大鼠的空腹血糖，緩解胰島素抵抗，調(diào)節(jié)血脂代謝紊亂。但是青錢柳緩解陰虛證侯表證，調(diào)節(jié)甲狀腺激素和環(huán)核苷酸的作用以及調(diào)節(jié)糖脂代謝的作用，是各自獨(dú)立的通路，還是存在著一定的聯(lián)系尚不明確，還需要進(jìn)一步深入的研究。