白振軍張慧宇郭敏芳

(1.山西大同大學(xué)中醫(yī)藥健康服務(wù)學(xué)院,山西大同 037009; 2.山西大同大學(xué)醫(yī)學(xué)院,山西大同 037009)

阿爾茨海默氏病(Alzheimer’s disease,AD)是一種常見的神經(jīng)退行性疾病,隨著世界人口老齡化的到來,AD 的發(fā)病率持續(xù)升高,導(dǎo)致了巨大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。由于到目前為止AD 確切的發(fā)病機(jī)制還不完全清楚,因此臨床上常用的治療仍然是一些對(duì)癥治療,沒有有效的病因療法[2]。氧化應(yīng)激是由于細(xì)胞過度暴露于活性氧(reactive oxygen species,ROS)等自由基引起的,是ROS 的形成與抗氧化防御能力之間出現(xiàn)不平衡的結(jié)果,ROS 會(huì)引發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)的氧化爆發(fā),并且參與神經(jīng)元細(xì)胞的死亡[3-4]。眾所周知,大腦是最易受氧化損傷的區(qū)域,因?yàn)樗难趿扛卟⑶铱寡趸瘎┫到y(tǒng)相對(duì)較弱[5],因此,氧化應(yīng)激在AD 的病理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[6]。這些研究證明抗氧化療法是氧化應(yīng)激相關(guān)疾病例如AD 的最有前途的治療選擇之一。

有證據(jù)表明,體內(nèi)排毒系統(tǒng)通過激活核因子E2相關(guān)因子(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)信號(hào)通路來對(duì)抗氧化劑的損傷而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[7]。Nrf2 是重要的氧化還原調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子,激活的Nrf2 從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核,激活其下游一系列內(nèi)源性氧化還原調(diào)節(jié)酶如血紅素加氧酶1(hemeoxygenase - 1,HO-1),超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和NADPH 醌氧化還原酶1(NADPH: quinone oxidoreductase 1,NQO1)來觸發(fā)細(xì)胞保護(hù)作用[8-9],且最新研究表明Nrf2 激活不足與AD 密切相關(guān)[10]。

毛蕊異黃酮是從黃芪中分離出來的有活性的黃酮類單體成分,具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤和神經(jīng)保護(hù)作用[11]。有研究表明,毛蕊異黃酮可以減輕AD 的氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng),改善 AD 的認(rèn)知缺陷[12]。為了進(jìn)一步研究毛蕊異黃酮的抗氧化應(yīng)激和神經(jīng)保護(hù)作用,本實(shí)驗(yàn)以人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y 為研究對(duì)象,用H2O2構(gòu)建氧化應(yīng)激細(xì)胞模型,研究毛蕊異黃酮的抗氧化保護(hù)作用及其可能的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人源神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y 細(xì)胞株由軍事醫(yī)學(xué)研究院軍事認(rèn)知與腦科學(xué)研究所提供。

1.2 主要試劑與儀器

毛蕊異黃酮(B9938)、牛血清白蛋白(B2064)購(gòu)自 Sigma-Aldrich 公 司 ( 美 國(guó)); 胎 牛 血 清(16140063)、青霉素-鏈霉素混合液(15140163)和高糖DMEM(21013024)購(gòu)自Gibco 公司(美國(guó));兔抗 Nrf2 抗 體 ( ab62352)、兔 抗 NQO1 抗 體(ab80588)、兔 抗 HO-1 抗 體 ( ab13243)、Alex Flour? 488 ( ab150077 ) 和 Alex Flour? 594(ab150080)標(biāo)記的山羊抗兔IgG、辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(ab205718)均購(gòu)自Abcam 公司(美國(guó));RIPA裂解液(P0013B)、細(xì)胞核蛋白和細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒(P0027)、4-甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)檢測(cè)試劑盒(ST316)、SOD 活性檢測(cè)試劑盒(S0103)和丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑(S0131M)均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司(中國(guó),上海)。

HERAcell 240i 二氧化碳培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo 公司;LA2-5A1 型生物安全柜購(gòu)自新加坡ESCO 公司;BX51 熒光顯微鏡購(gòu)自日本Olympus 公司;H1M 全功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)伯騰儀器有限公司;SYSTEM GelDoc XR+凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

SY5Y 細(xì)胞用高糖DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基(含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素混合液),置于5%CO2、37℃的CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)80%的時(shí)候進(jìn)行傳代。

1.3.2 毛蕊異黃酮濃度篩選

將指數(shù)生長(zhǎng)期的SY5Y 細(xì)胞以每毫升5×103個(gè)的密度接種于96 孔板中。待細(xì)胞貼壁后加入不同終濃度的毛蕊異黃酮(0、0.035、0.070、0.140、0.281 μmol/mL),每個(gè)濃度設(shè)6 個(gè)復(fù)孔。24 h 后每孔加入20 μL 的 MTT 溶液(0.012 mol/L),37℃繼續(xù)孵育 3～4 h 后離心棄上清液,每孔加入150 μL 的DMSO,震蕩5 min 使結(jié)晶溶解,酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm 波長(zhǎng)各孔的光密度值。細(xì)胞的存活率(%)= (加藥孔-調(diào)零孔)/(對(duì)照孔-調(diào)零孔)×100%。選取可以增加細(xì)胞活性或者對(duì)細(xì)胞活性無明顯影響的毛蕊異黃酮濃度作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的使用濃度。

1.3.3 SY5Y 細(xì)胞氧化損傷模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組

采用H2O2刺激SY5Y 細(xì)胞建立氧化損傷模型。實(shí)驗(yàn)分為 3 組:PBS 對(duì)照組、H2O2(50 μmol/L)模型組、H2O2(250 μmol/L)+毛蕊異黃酮(0.035 μmol/mL)干預(yù)組。培養(yǎng)24 h 后,收集上清并離心,-80℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 MTT 法檢測(cè)毛蕊異黃酮對(duì)SY5Y 細(xì)胞的保護(hù)作用

藥物作用24 h 后,MTT 法檢測(cè)各組細(xì)胞活性,評(píng)估毛蕊異黃酮對(duì)H2O2致細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。

1.3.5 氧化應(yīng)激指標(biāo)的檢測(cè)

取出凍存?zhèn)溆玫募?xì)胞上清液,分別按照試劑盒說明書檢測(cè)丙二醛MDA 的水平和超氧化物歧化酶SOD 的活性。

1.3.6 免疫熒光染色檢測(cè)SY5Y 細(xì)胞中Nrf2 的核轉(zhuǎn)位情況和HO-1 的表達(dá)

為檢測(cè)毛蕊異黃酮干預(yù)SY5Y 細(xì)胞是否可以使Nrf2 表達(dá)增加并轉(zhuǎn)移到核內(nèi),采用免疫熒光染色檢測(cè)細(xì)胞中Nrf2 表達(dá)的變化,同時(shí)檢測(cè)HO-1 的表達(dá)。將細(xì)胞接種于放置好細(xì)胞爬片的24 孔板中,密度為每毫升4×105個(gè),各組分別加入H2O2和毛蕊異黃酮,培養(yǎng)24 h 后,用4%多聚甲醛固定30 min,用含有0.3% Triton X-100 和 1% BSA 的 PBS 室溫下封閉1 h,加入兔抗小鼠Nrf2 或者兔抗小鼠HO-1 一抗,4℃孵育過夜,加488 或者594 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 二抗,室溫下孵育2 h,5%甘油封片,熒光顯微鏡掃描觀察。

1.3.7 Western blot 法檢測(cè) SY5Y 細(xì)胞總 Nrf2、細(xì)胞核內(nèi) Nrf2、NQO1 和 HO-1 蛋白水平

藥物作用24 h 后,用RIPA 裂解液或者是細(xì)胞核蛋白和細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒提取蛋白,BCA 法進(jìn)行蛋白定量。采用10% SDS-PAGE 不連續(xù)凝膠分離蛋白,轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉封閉1 h,加入用封閉液稀釋的兔抗小鼠 Nrf2 抗體(1 ∶500)、兔抗小鼠NQO1(1 ∶500)或兔抗小鼠 HO-1 抗體(1 ∶500),4℃冰箱孵育過夜,次日加入HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(1 ∶5 000),2 h 后滴 ECL 發(fā)光液于膜上,隨后用Bio-Rad 凝膠成像系統(tǒng)顯影并分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

計(jì)量資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)來表示,采用SPSS 15.0 對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,組間比較采用單因素方差分析,P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 毛蕊異黃酮濃度篩選

通過MTT 法檢測(cè)毛蕊異黃酮對(duì)細(xì)胞的毒性作用,篩選合適的藥物濃度,結(jié)果顯示毛蕊異黃酮終濃度 為 0.035 μmol/mL、0.070 μmol/mL、0.140 μmol/mL、0.281 μmol/mL 時(shí)的細(xì)胞活力分別為109.83% ± 8.57%、100.67% ± 11.64%、80.83% ±7.94%、50.33% ± 9.22%,與對(duì)照孔 99.33% ±7.34% 相比,0.035 μmol/mL 毛蕊異黃酮可以增加細(xì)胞活性(P＜0.05),隨著藥物濃度的增加,細(xì)胞活力隨之降低,0.070 μmol/mL 毛蕊異黃酮處理組的細(xì)胞活性和對(duì)照組之間無顯著性差異(P＞0.05),而0.140 μmol/mL 毛蕊異黃酮處理組的細(xì)胞活性顯著降低,與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)(圖1),因此后期實(shí)驗(yàn)毛蕊異黃酮選擇0.035 μmol/mL 作為藥物干預(yù)濃度。

2.2 毛蕊異黃酮對(duì)H2O2 誘導(dǎo)SY5Y 細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

用 250 μmol/L H2O2刺激 SY5Y 細(xì)胞,藥物組同時(shí)加0.035 μmol/mL 毛蕊異黃酮進(jìn)行處理,藥物作用24 h 后采用 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞活性。結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,H2O2損傷細(xì)胞24 h 后,細(xì)胞活力明顯下降(P＜0.001),而毛蕊異黃酮能夠顯著抑制H2O2對(duì)SY5Y 細(xì)胞造成的損傷作用,細(xì)胞活力明顯增加(P＜0.01,圖2)。

2.3 毛蕊異黃酮對(duì)H2O2 誘導(dǎo)SY5Y 產(chǎn)生的SOD和MDA 的影響

測(cè)量自由基的氧化終產(chǎn)物丙二醛(MDA)和抗氧化酶(SOD)的量能有效的反應(yīng)細(xì)胞的氧化應(yīng)激狀態(tài)。與PBS 對(duì)照組比較,H2O2刺激后導(dǎo)致SY5Y細(xì)胞中MDA 含量明顯升高(P＜0.001),SOD 活性明顯降低(P＜0.001)。毛蕊異黃酮能夠顯著降低MDA 的水平(P＜ 0.001),提高 SOD 的活性(P＜0.01,圖3),抑制H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷。

2.4 毛蕊異黃酮對(duì) H2O2 誘導(dǎo) SY5Y 細(xì)胞表達(dá)Nrf2 的影響

為了探討毛蕊異黃酮抑制H2O2致SY5Y 細(xì)胞氧化損傷作用的機(jī)制,本研究采用免疫熒光和Western blot 方法分析了Nrf2 的表達(dá)及其核轉(zhuǎn)位情況。免疫熒光結(jié)果顯示,PBS 對(duì)照組中的Nrf2 主要分布在細(xì)胞質(zhì)中,細(xì)胞核中的含量較少,模型組細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)Nrf2 含量均有所減少,而毛蕊異黃酮作用24 h 后,細(xì)胞核中的Nrf2 含量明顯增加,胞質(zhì)內(nèi)Nrf2 含量減少,說明毛蕊異黃酮可以促進(jìn)Nrf2激活并向核內(nèi)轉(zhuǎn)位。Western blot 蛋白定量結(jié)果發(fā)現(xiàn),與PBS 對(duì)照組比較,H2O2組總的Nrf2 和細(xì)胞核內(nèi)Nrf2 表達(dá)均降低(P＜0.05),而毛蕊異黃酮作用后總的Nrf2 和細(xì)胞核內(nèi)Nrf2 表達(dá)均明顯增加(P＜0.001,圖4)。

2.5 毛蕊異黃酮對(duì)H2O2 誘導(dǎo)的SY5Y 細(xì)胞抗氧化蛋白NQO1 和HO-1 表達(dá)的影響

免疫熒光檢測(cè)HO-1 的表達(dá),同時(shí)利用Western blot 法檢測(cè) NQO1 和 HO-1 的表達(dá)。免疫熒光結(jié)果顯示毛蕊異黃酮可以增加 HO-1 的表達(dá),同時(shí)Western blot 結(jié)果顯示,與PBS 對(duì)照組相比,模型組細(xì)胞NQO1 和HO-1 的表達(dá)顯著降低(P＜0.01)。與H2O2組相比,毛蕊異黃酮處理組NQO1 和HO-1表達(dá)明顯增加(P＜0.05,圖5)。

圖1 不同濃度毛蕊異黃酮對(duì)SY5Y 細(xì)胞活性的影響Figure 1 Effect of different concentrations of calycosin on the activity of SY5Y cells

圖2 毛蕊異黃酮對(duì)H2O2 誘導(dǎo)SY5Y 細(xì)胞損傷的保護(hù)作用Figure 2 Protective effect of calycosin on H2O2 induced SY5Y cell damage

圖3 毛蕊異黃酮對(duì)H2O2 誘導(dǎo)SY5Y 細(xì)胞產(chǎn)生的SOD 和MDA 的影響Figure 3 Effect of calycosin on the level of SOD and MDA induced by H2O2 in SY5Y cells

圖4 毛蕊異黃酮對(duì)H2O2 損傷SY5Y 細(xì)胞Nrf2 表達(dá)的影響Figure 4 Effect of calycosin on the expression of Nrf2 in SY5Y cells injured by H2O2

3 討論

氧化應(yīng)激已被認(rèn)為是AD 的發(fā)病機(jī)制之一[13]。與其他器官相比,由于高氧消耗和缺乏抗氧化酶,神經(jīng)元更容易受到自由基的破壞[14]。在AD 患者的組織樣本中明顯出現(xiàn)了氧化應(yīng)激增加的跡象,并在疾病中證明了由ROS 直接誘導(dǎo)或者是由脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物間接誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)修飾[15]。有研究發(fā)現(xiàn)許多用于AD 治療的化合物具有有效的抗氧化特性,例如司立吉林,黃酮類,褪黑素和類胡蘿卜素等[16]。因此本實(shí)驗(yàn)研究毛蕊異黃酮的抗氧化應(yīng)激效果,進(jìn)一步為黃酮類藥物治療AD 提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

毛蕊異黃酮,從黃芪中分離出來的一種有效成分,它的極性很小,不僅可以去除游離的自由基,而且可以穿透生物膜脂質(zhì)雙層去除結(jié)合的活性氧并延遲脂質(zhì)生物膜的過氧化,從而提高人體的抗氧化應(yīng)激能力[17]。且有研究表明,毛蕊異黃酮可以通過減少氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng),并改善AD 模型小鼠的認(rèn)知功能,并緩解AD 的癥狀[12]。也有研究顯示,毛蕊異黃酮可以減輕缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖導(dǎo)致的PC12 細(xì)胞凋亡,發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[18]。然而,關(guān)于毛蕊異黃酮抗氧化應(yīng)激的機(jī)制還不十分清楚。SHSY5Y 是多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞,被廣泛用于研究神經(jīng)退行性疾病如AD 和PD 的細(xì)胞模型[19]。因此本實(shí)驗(yàn)采用H2O2刺激SH-SY5Y 建立氧化應(yīng)激損傷模型,檢測(cè)毛蕊異黃酮的抗氧化作用及其可能的機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示毛蕊異黃酮濃度在0.035 μmol/mL 時(shí),可以增加細(xì)胞活性,0.140 μmol/mL 時(shí)細(xì)胞活性開始降低,因此我們選定0.035 μmol/mL 為毛蕊異黃酮的干預(yù)濃度。同時(shí)結(jié)果顯示,250 μmol/L H2O2刺激SY5Y 細(xì)胞可以使其細(xì)胞存活率降低,而毛蕊異黃酮可以抑制H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷,使細(xì)胞存活率增加,表明毛蕊異黃酮對(duì) H2O2誘導(dǎo)的SY5Y 細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷具有保護(hù)作用。

圖5 毛蕊異黃酮對(duì)H2O2損傷SY5Y 細(xì)胞NQO1 和HO-1 表達(dá)的影響Figure 5 Effect of calycosin on the expression of NQO1 and HO-1 in SY5Y cells injured by H2O2

MDA 是自由基發(fā)生脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物,SOD是體內(nèi)自由基的天然清除劑,可以保護(hù)機(jī)體免受氧化損傷,因此MDA 和SOD 是反應(yīng)氧化應(yīng)激的兩個(gè)重要指標(biāo)[20]。本研究發(fā)現(xiàn),H2O2可使 SY5Y 細(xì)胞MDA 含量明顯升高,SOD 活性明顯降低。毛蕊異黃酮處理組SY5Y 細(xì)胞MDA 含量降低,SOD 活性顯著升高。顯示毛蕊異黃酮可通過增加抗氧化酶SOD的活性來抵抗H2O2所造成的氧化性損傷,表明其具有良好的抗氧化應(yīng)激作用。

Nrf2/HO-1 信號(hào)通路是維持細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵途徑[21]。Nrf2 激活并從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核,進(jìn)而誘導(dǎo)下游保護(hù)性靶基因NQO1 和HO-1 的表達(dá),從而維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)[22]。有研究表明,H2O2刺激SY5Y 細(xì)胞后,Nrf2 的轉(zhuǎn)錄活性降低,細(xì)胞核內(nèi)Nrf2 及其下游分子 NQO 和 HO-1 的表達(dá)明顯降低[23]。本研究結(jié)果表明,H2O2刺激細(xì)胞后總Nrf2及核內(nèi)Nrf2 的表達(dá)均較對(duì)照組減少,而毛蕊異黃酮干預(yù)能夠激活Nrf2 使其表達(dá)增加并促使其向核內(nèi)轉(zhuǎn)位。同樣Western blot 蛋白定量結(jié)果表明,毛蕊異黃酮干預(yù)能夠明顯增加H2O2損傷后總Nrf2 和核內(nèi)Nrf2 的表達(dá),并且能夠明顯增強(qiáng)H2O2損傷后Nrf2誘導(dǎo)的II 相輔酶 NQO1 和HO-1 的表達(dá),提示毛蕊異黃酮可能通過激活Nrf2/HO-1 信號(hào)通路發(fā)揮抗氧化應(yīng)激的保護(hù)作用。

綜上所述,毛蕊異黃酮能夠抵抗H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y 氧化損傷,其機(jī)制可能是激活了Nrf2,并促進(jìn)Nrf2 向核內(nèi)轉(zhuǎn)位,進(jìn)而上調(diào)了其下游抗氧化酶NQO1 和HO-1 的表達(dá),然而毛蕊異黃酮發(fā)揮抗氧化損傷和神經(jīng)保護(hù)作用的確切機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。